Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Это исследование было поддержано голландского общества рака (ALPE 2013-6371) и Egbers фонд для ВОНК. Мы благодарим Рабочей группе голландской AML-MRD для сотрудничества и плодотворного обсуждения для непрерывного совершенствования и стандартизация AML-моб.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission:+an+integrated-risk+adapted+approach.">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li><li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia:+which+platforms+are+ready+for+&amp;#34;prime+time&amp;#34;?.">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &amp;#34;prime time&amp;#34;?.</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li><li>Kr&#246;nke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia:+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group.">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia:+data+from+the+HOVON/SAKK+AML+42A+study.">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li><li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97/MRC+AML12+protocol.">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li><li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+in+AML:+time+for+redefinition+of+CR?.">MRD in AML: time for redefinition of CR?.</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li><li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia.">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+stem+cell+frequency:+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+minimal+residual+disease+(MRD)+in+leukemia:+a+changing+definition+and+concept?.">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?.</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

Коктейли антитела, используемый для проверки трубки стволовых клеток в нескольких независимых институтах были любезно предоставлены BD. Авторы не имеют ничего сообщать по отношению к этой рукописи.

Множество данных, доступных, которые показывают доказательства для моб позитивности, связанный с бедными выживания, и поэтому MRD оценки может улучшить пациента исход, предоставляя дополнительную прогностическую информацию, на которой клинические решения могут быть сделаны. Следовательно последовательного и согласованного метода иммуно фенотипического оценки MRD важно в конечном итоге улучшить пациента терапии. Это также имеет важное значение при сравнении клинических исследований различных клинических сайтов, и может в конечном итоге помощь в клинической решение приготовления и сервировки качестве суррогатной клинических конечной точки для общего выживания. Понятие, что твердые руководящие принципы необходимы для точной и последовательной MRD измерений привело к согласованным действиям Европейской сети лейкемии (АНО) разработать современные руководящие принципы. Этот всеобъемлющий документ будет опубликовано поздно-2017 и будет играть важную роль для многих исследовательских групп и лабораторий, двигаться вперед.
Важнейшие шаги в рамках протокола
Важным и часто упускается из виду аспектом MRD анализа является влияние качества образца на точное определение моб. Это более очевидной, когда материал должен перевозиться в других институтов глобальной клинических испытаний, учитывая дополнительные оперативные соображения, которые должны приниматься во внимание в этой обстановке. Чтобы уменьшить риск смешивая пациента информацией и своевременную доставку образцов адекватного управления имеет решающее значение. Опять же на данном этапе транспорта правильной формы и/или импорт в Электронная больница систем с четких назначений запрошенного анализа не требуется. Отмечая на сцену в терапии MRD выборки также имеет решающее значение, так как это может быть актуально для клинических решений (например, после второго курса терапии) и поэтому должны быть четко определены. Использование фиктивных данных (таких как к примеру 1 января в год рождения) увеличивает риск смешивая пациентов или анализа. Если требуется по закону, следует использовать альтернативный способ анонимной идентификации.
Все образцы для Иммунофенотипирование должны обрабатываться преференциально в течение 24 h коллекции. Хотя не рекомендуется, костного мозга и периферической крови можно все еще обрабатываются и анализируются при хранении до 72 ч при комнатной температуре. Кроме того, все расправы с материалом можно наилучшим образом выполнить в стерильных условиях, поэтому дальнейшие криоконсервирования клеток в биобанках (местных) остается актуальным: многие клинические исследования имеют дополнительные анализы для дальнейшего изучения лейкоз клетки с уважение к молекулярной, иммуно Фенотипические и функциональные особенности, выполняться на более позднем этапе. Однако подробная информация о biobanking не входят в сферу этой рукописи.
Использование MRD как диагностический инструмент подразумевает, что она нуждается аккредитованная лаборатория, не только для проточной цитометрии, но и относительно контроля качества MRD оценки. Это может потребовать распространение образцов конкретные справочные лаборатории или (перерегистрации) анализ потока файлов с измерениями MRD Справочник команд.
Эта статья описывает наиболее важные действия из коллекции аспирата костного мозга для определения моб в клинических образцах - требующие вся команда экспертов с конкретными задачами, обязанности и с частыми коммуникации для эффективного Характеристика и анализ. Поскольку каждая задача имеет решающее значение для процедуры, рекомендуется иметь звук логистики, включая протоколы в каждой лаборатории и достаточно резервного персонала, которые были специально подготовлены для выполнения этой задачи. Кроме того поскольку есть некоторые относительно субъективных шаги в части процедур (особенно LAIP и LSC аберрантных маркер идентификации), важно иметь обсуждений о окончательный результат команды, и окончательный доклад уполномоченных команда Супервайзеры. Нынешние усилия преследуют создание компьютерного программного обеспечения, который поможет стандартизировать MRD анализ (LAIP и LSC).
Модификация и устранение неполадок
Каждая лаборатория может иметь свой собственный набор антител, которые могут использоваться для определения различных субпопуляций, хотя наличие стандартизированных позвоночника маркеров имеет важное значение для сопоставимые результаты, изложенные в руководящих принципах состояние искусства АНО MRD измерений документа упомянутые выше. Независимо от выбранной маркеров, что есть некоторые вопросы, которые могут затруднить анализ результатов и должны приниматься во внимание.
Ограничения метода
Выявление LAIP и LSC аберрантных маркер выражения сначала начисленных на диагноз и наблюдение за время (во время и после терапии) для точной характеристики MRD фенотип. В то время как более 95% из пациентов может оцениваться через LAIP или LSC (или оба), все еще некоторые пациенты не определено LAIPs или не CD34 + CD38-LSCs представить с CD34 негативные взрывов или отсутствует пример диагностики. В таких случаях, это все еще стоит попытаться измерить MRD с группой антител, как широкие, как количество доступных ячеек позволяет и выберите наиболее надежным (давая сильнейшие различия лейкозных клеток) LAIP. Учитывая, что доля пациентов, которые в конечном итоге рецидив не напоминают полностью диагноз иммунофенотип, вследствие неоднородности ПФТ болезнь, измерения широкий группа антител на моб рекомендуется в любом случае. Эти сдвиги иммунофенотипических включают взрыв клетки и LSCs и было показано во время терапии16 и измеримых болезни могут быть основаны на этих так называемых предстоящих населения. В это время однако, она не была определена ли все иммунофенотипических подгрупп населения приведет к рецидиву болезни, и поэтому не общепринятой практикой доклад с учетом MRD-терапия основана на эти клетки в клинических испытаниях. Важно отметить, что риск отсутствует LSC вследствие перемещения населения уменьшается подход одной трубки, в которой наиболее важных aberrancy определение маркеров находятся в одном проточной цитометрии (PE) канал14.
Значение в отношении существующих методов
Метод, описанный в настоящем Протоколе опирается на определение одной или более LAIPs, ячейки, которые выполняются во время терапии. Недостатком этого метода является, что он был недавно показал, что LAIP может измениться во время терапии. Таким образом некоторые предстоящих населения с различными аберрантных маркеры могут быть пропущены. Чтобы обойти это, было бы лучше измерить все аберрантных маркеры, а не только те, нашли в диагностике. Тогда это будет похож на «отличается от обычных» подход, который используется в нескольких лабораториях17.
Будущие приложения
Недавно моб получил дополнительное внимание Роман клинических судебного дизайн. В эпоху специализированного лечения и целевых лекарственной терапии использование MRD как результат мера позволит сократить время, необходимое для установления клинической эффективности Роман лечения, в конечном счете позволит быстрее введение срочно терапевтических параметры в клинику. Значение соответствующего материально-технического и практического выполнения согласованной оценки MRD имеют решающее значение для будущего успеха лечения ПФТ, как FDA в настоящее время изучает возможности использования MRD качестве суррогатной конечной точки вместо общей выживаемости меры18.

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) есть злокачественность костного мозга характеризуется дефекты в программе созревания, с ненормальным распространения и накопления клеток миелоидного progenitor, ингибирование нормального кроветворения, и в конечном итоге провал костного мозга . Эта болезнь является весьма неоднородной, в отношении морфологии, иммунофенотип, цитогенетика, молекулярные аберраций и ген выражение подписей, а также для лечения и лечения результат1,2. Текущее управление включает в себя индукционной химиотерапии с целью достижения полной ремиссии (CR), следуют после ремиссии лечение, которое во многом ориентируется на результаты молекулярных, цитогенетическое и иммунофенотипических исследования и состоит из либо несколько курсов дополнительной химиотерапии или трансплантации стволовых клеток (аутологичных и аллогенных)3. Несмотря на высокий ремиссии курсы после интенсивной химиотерапии до 90%, 5-летняя выживаемость взрослых только около 30% - 40%, преимущественно за счет развития рецидивов, которые часто устойчивы к химиотерапии и тем самым очень трудно поддается лечению. Результат в детей лучше, хотя также рецидив приблизительно одну треть. Таким образом раннее обнаружение неминуемой эскалации будет заполнить неудовлетворенных потребностей в медицинских и может направлять терапии после ремиссии4.
Остаточного заболевания после терапии может отражать сумму всех диагностики и сопротивления после диагностики механизмов/факторов; Поэтому его измерения может быть прогнозные и инструментальные для направления лечения. Возможность ключевом остаточной болезни (ранее назывался минимальной остаточной болезни и теперь именуется как поддающиеся оценке остаточной болезни или MRD) намного ниже морфологический критерий 5% Доменная клеток меняется ландшафт классификация риска. В настоящее время методами в основном используется для обнаружения MRD являются два потока цитометрии-на основе и молекулярной, последний оценивается путем обратной транскриптазы ПЦР (RT-ПЦР)5 или, хотя в преждевременной стадии, следующего поколения виртуализации (НГС). Многие исследования у взрослых, а также как и дети уже продемонстрировал, что различные подходы MRD обеспечивают сильный прогностическую информацию в AML как после индукции и консолидации терапии6,7и новое определение бремени болезней ( превосходит морфологических CR) в настоящее время становится8. Это предполагает, что MRD оценены потока и/или молекулярных методов должно стать и фактически уже становятся, стандартные в каждом клинических испытаний в борьбе с отмыванием денег.
Эта рукопись обсуждается процедура цитометрии подробные потока получить точные и воспроизводимые иммунофенотипических характеристика моб в образцах костного мозга, включая костного выборки и обработки процедур предшествующих проточной цитометрии. Наличие хорошего качества костного образцов в диагностике и последующие решающее значение для успеха этого измерения различных клинических баз и клинических испытаний. В самом деле эти предварительно аналитические соображения являются также жизненно важное значение для молекулярной (ПЦР и NGS) MRD подходов. Для характеризации иммунофенотипических моб они выразили маркеры в сочетании с нормальной миелоидного и прародитель маркеры, чтобы идентифицировать связанные лейкемии иммунофенотип (LAIP)9. MRD меры результирующей многих факторов, влияющих на ответа на терапию, например встроенные или приобретенных лейкемии лекарственной устойчивости, фармакодинамики и кинетика терапии, иммунной наблюдения и обеспечения соблюдения. Таким образом очень сильный пост диагностики прогностические параметр связанные с клинических исходов при делят на пороговый уровень, определяется приемника-рабочая характеристика (ROC) анализ является моб. Для нашего взрослого AML когорты HOVON 42а учиться, пороговый уровень установлен на 0.1% LAIP позитивных клеток/всего белых кровяных клеток. Используя этот критерий для определения отрицательных против позитивные MRD статуса, можно определить группа пациентов, которые имеют значительно хуже случаев рецидива, рецидивов свободно и общей выживаемости6. Кроме того мы описываем измерения незрелых, лекарственной устойчивостью лейкозных клеток с стволовых клеток подобные функции (CD34 + CD38-лейкоз стволовые клетки, или LSC), который предлагает сильный предиктор пациента исход10. Вместе LAIP и LSC подходов к форме потока гранулярных MRD подход. LAIP подход подходит для примерно 90% больных, в то время как LSC подход может быть применен в примерно 80% больных. Вместе над 95% из пациентов может быть оценена для одного параметра или оба.
Наконец эта публикация содержит подробное описание оперативной оценки MRD подачей cytometry. Это включает в себя: 1) согласование и стандартизация процедур отбора проб костного мозга, 2) образца Транспорт Руководство 3) подробное описание обнаружения лейкозных клеток с СУИМ, используя несколько панелей антитела, включая одну ячейку трубки подходы характеризовать LSC, 4) создание СУИМ машины для стандартных измерений, 5) аналитические программы для моб измерений и 6) аналитические программы для обнаружения LSC.
Мы стремимся показать все аспекты процедуры, в том числе подготовки пробы, поскольку это редко обсуждаются в то время как это является важным вопросом для качества конечный результат. Клинических процедур, используемых для оценки гемопоэтических клеток в костном костного аспирации и биопсии. Они выполняются вместе с полный анализ крови (CBC) и мазок крови. Оптимальный метод для аспирации костного имеет решающее значение для точной диагностики и контроля для моб измерения. Кроме того успешные костного аспирата должен содержать достаточное количество клеток для выполнения LAIP и LSC анализа потока (по крайней мере 10 миллионов жизнеспособных клеток). Здесь мы описываем метод для выполнения костного аспирации и руководящие принципы, которые должны привести к адекватной ячейки выборки (и предел потенциал для гемодилюции) необходимые для точной диагностики и дополнительных исследований. Эти предварительно аналитические соображения являются также жизненно важное значение для молекулярной (ПЦР и NGS) MRD подходов. Все образцы для Иммунофенотипирование должны обрабатываться преференциально в течение 24 h коллекции. Хотя не рекомендуется, костного мозга и периферической крови можно все еще обрабатываются и анализируются при хранении до 72 ч при комнатной температуре. Кроме того все расправы с материалом должно выполняться в стерильных условиях, для того чтобы криоконсервирования стерильных клеток для последующего исследования и качества оценки и т.д.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Ответ критерии в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) недавно было восстановлено, с морфологической экспертизы, используются для определения, является ли пациенты достигли полной ремиссии (CR). Примерно половина взрослых пациентов, кто вступил CR будет рецидивов в течение 12 месяцев из-за нарост остаточного ПФТ клеток в костном мозге. Количественный этих оставшихся лейкозных клеток, известный как минимальным или поддающихся оценке остаточной болезни (моб), может быть надежной biomarker для прогнозирования этих рецидивы. Кроме того ретроспективный анализ нескольких исследований показал, что наличие моб в костном мозге пациентов ПФТ коррелирует с бедными выживания. Это не только лейкозных населения, отражение клетки укрывательство лейкемии связанные иммунной фенотип (LAIP), связанные с клинических исходов, но так незрелых низкой частоты субпопуляция стволовых клеток лейкемии (LSC), оба из которых может быть мониторинг через проточной цитометрии моб или моб подобных подходов. Наличие чувствительных анализы, позволяющие обнаружения остаточных лейкемии (стебель) клеток на основе конкретных заболеваний или болезней, связанных функций (аномальные молекулярных маркеров или аномальным иммунофенотипа) имеют радикально усовершенствовать оценку MRD в борьбе с отмыванием денег. Однако учитывая присущие неоднородность и сложность ПФТ болезнь, методы отбора проб костного мозга и моб и LSC анализа должны быть согласованы когда это возможно. В этой рукописи, мы описываем подробная методология для адекватного костного аспирата выборки транспорт, образец обработки для оптимального потока многоцветные цитометрии оценки и стробирования стратегий для оценки MRD и СОП для помощи в терапевтических решений для борьбы с отмыванием денег пациентов.

В 90% ПФТ пациентов могут быть определены по крайней мере один LAIP. Чтобы создать точные проценты LAIP + клеток примитивные клетки взрыва на диагноз, соответствующий параметр Доменная ворот имеет решающее значение и требует проверки, как визуализировать на Figure 3. Пример каждого пациента, укрывательство определенного типа aberrancy на CD34 + примитивные клетки визуализированы на рисунке 5. Для измерения MRD на последующих вверх, ранее определенных LAIP + клетки воротами и определяется как процент LAIP + клеток ТПН. Поэтому установление этой ворот имеет решающее значение для достижения правильные результаты моб. На рисунке 6 показан после второго цикла индукционной терапии пациент, который остается в полной ремиссии и пациента, что рецидивы после того MRD положительные результаты (≥ 0,1%).
Текущий протокол пригоден только для определения стволовых клеток в CD34 + клеток, поскольку тщательный характеристика этот отсек показал, что CD38-население испытывает наиболее мощным стволовых клеток как часть. Для того чтобы отделить LSC от HSC в этой фракции, используются дополнительные маркеры. Чаще всего отдельные маркеры, чтобы отличить LSC являются CD45RA и combi канал, укрывательство 6 конкретных LSC маркеры, помечены PE. На основе дальнейшей клинической оценки, пороговый уровень ≥ 0,004% был определен как LSC-позитивных и был связан с хуже выживания в диагностике, в то время как пороговый уровень 0,0001% был использован в кокон до10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Рисунок 1 : Костный мозг мазка. A) здорового донора и пациента B) бод (FAB 5 подтип). Гимзе показано на 100 крат. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Рисунок 2 : Правильно упаковочного материала для биологических жидкостях. Более подробную информацию о правилах и правилах транспортировки биологических жидкостей можно найти на веб-сайте15 центров по контролю и профилактике заболеваний. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Рисунок 3 : Стробирования стратегии для определения взрыва клетки. A) стробирование CD45dim, B) стробирование CD34 + взрывов.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Рисунок 4 : Стробирования лимфоцитов. A) синие клетки являются WBC, показано в FSC/SSC сюжет, B) зеленые клетки являются лимфоциты характеризуются CD45высокой/SSCнизко, C) в показаны примеры отрицательность CD34, D) отрицательность CD117 и E) негатива для CD13, F различных типов клеток Обзор населения дерево. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Рисунок 5 : LAIPs диагноз AML. A) LAIP на основе крест линии aberrancy (CD7 на CD33 выражая клетки), Б) LAIP на основе асинхронной дифференциации (CD11b на CD13 выражая клетки), C) LAIP на основании Гиперэкспрессия по сравнению с нормальной клетки (CD34очень высокий на CD13 выражая клетки), D). LAIP на основе underexpression, по сравнению с нормальной клетки (HLA-DRнизкой на CD33 выражая клетки). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Рисунок 6 : LAIP, а затем во время терапии. Определение A) LAIP в диагностике (CD34 +/ CD13 +/ CD33-) и потеря LAIP во время последующего у пациентов, которые остались в непрерывной полной ремиссии, определение B) LAIP в диагностике (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) и сохранение LAIP во время последующего у пациента ВОЗ рецидив. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Рисунок 7 : Стволовых клеток стробирования. ) Gating различных CD34 +/ CD38 населения на основе бусины (CD38низким – ниже верхней границы бусы, а CD38очень низкой определяются как истинный отрицательные клетки, представляющие LSC и расположены ниже медианы бисер), B) два примеры пациентов с отличием между HSC и LSC в последующей деятельности на основе CD45RAneg и CD45RApos выражение. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Дополнительный файл 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.</a>
Дополнительный файл 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.</a>
Дополнительного файла 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Обнаружение минимальной или поддающихся оценке остаточной болезни (моб) является важным прогностическим biomarker для совершенствования оценки рисков и прогнозирования рецидивов в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Эти всеобъемлющие руководящие принципы и рекомендации с передовой практикой для последовательной и точной идентификации и выявления моб, может помочь в принятии эффективных решений лечения бод.

Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Измерение ремоделирования костей и воссоздания микроокружения опухоли и кости с использованием кокультуры Кальварии и гистоморфометрии

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Моделирование первичных опухолей костей и метастазов в кости с имплантацией солидного опухолевого трансплантата в кость

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Внутрибрюшинная трансплантация при возникновении острого миелоидного лейкоза у мышей

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...