Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Esta investigación ha sido apoyada por la sociedad holandesa de cáncer (ALPE 2013-6371) y Fundación Egbers para VONK. Agradecemos al grupo de trabajo de AML-MRD holandés para la colaboración y fructíferas discusiones para la mejora continua y la estandarización de AML-MRD.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission:+an+integrated-risk+adapted+approach.">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li><li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia:+which+platforms+are+ready+for+&amp;#34;prime+time&amp;#34;?.">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &amp;#34;prime time&amp;#34;?.</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li><li>Kr&#246;nke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia:+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group.">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia:+data+from+the+HOVON/SAKK+AML+42A+study.">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li><li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97/MRC+AML12+protocol.">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li><li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+in+AML:+time+for+redefinition+of+CR?.">MRD in AML: time for redefinition of CR?.</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li><li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia.">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+stem+cell+frequency:+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+minimal+residual+disease+(MRD)+in+leukemia:+a+changing+definition+and+concept?.">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?.</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

Los cócteles de anticuerpo utilizados para la validación del tubo de la célula de vástago en varios institutos independientes fueron amablemente proporcionados por BD. Los autores no tienen nada que revelar en relación con este manuscrito.

Amplios datos disponibles que muestran evidencia de positividad MRD asociada a supervivencia pobre, y por lo tanto evaluación de MRD puede mejorar resultados de los pacientes por proporcionar información pronóstica adicional sobre la que se pueden hacer las decisiones clínicas. Por lo tanto, un método consistente y armonizado para la evaluación inmuno-fenotípico de MRD es esencial para en última instancia mejorar la terapia del paciente. Esto también es importante cuando se comparan estudios clínicos a través de diferentes centros clínicos, y puede en última instancia, ayuda en la clínica la decisión haciendo y sirviendo como un extremo clínico de sustituto para la supervivencia general. La idea de que directrices sólidas están garantizadas para las mediciones de MRD precisas y coherentes ha conducido a una acción concertada de la red europea de leucemia (ELN) a directrices de diseño de vanguardia. Este documento completo será publicado tarde-2017 y será fundamental para muchos grupos de estudio y laboratorios de avanzar.
Pasos críticos en el protocolo
Un aspecto a menudo pasado por alto e importante de análisis MRD es el impacto de la calidad de la muestra en la determinación exacta de MRD. Esto es más evidente cuando el material tiene que ser transportado a otros institutos en los ensayos clínicos mundiales dados el consideraciones operativas adicionales que deben tomarse en cuenta en este entorno. Para reducir el riesgo de mezclar para arriba paciente información y entrega oportuna de la administración adecuada de las muestras es crucial. Una vez más, en esta etapa del transporte los formularios correctos y/o importación en sistemas electrónicos hospital con asignaciones claras de los análisis solicitados se requiere. Teniendo en cuenta la etapa en la terapia de toma de muestras de MRD también es crucial puesto que puede ser relevante para la decisión clínica (por ejemplo después de segundo curso de la terapia) y, por tanto, debe definirse claramente. El uso de información falsa (como por ejemplo el 1 de enero por el año de nacimiento) aumenta el riesgo de mezclar pacientes o análisis. Si es requerido por ley, debe utilizarse una forma alternativa de anónimas de identificación.
Todas las muestras de immunophenotyping deben procesarse preferencial dentro de las 24 h de colección. Aunque no recomendable, muestras de sangre periférica y médula ósea pueden todavía ser procesadas y analizadas conservado hasta 72 h a temperatura ambiente. Además, todas las manipulaciones con el material pueden mejor realizarse en condiciones estériles, para posterior criopreservación de células en biobancos (local) sigue siendo pertinente: muchos estudios clínicos con análisis adicionales para investigar las células de leucemia con respecto a las características moleculares, inmuno-fenotípicas y funcionales para llevar a cabo en una etapa posterior. Sin embargo detalles de biobancos no están dentro del alcance de este manuscrito.
Uso de MRD como una herramienta de diagnóstico implica que es necesario un laboratorio acreditado, no sólo para citometría de flujo, sino también en cuanto a control de calidad de evaluación de MRD. Esto puede requerir la distribución de muestras a laboratorios de referencia específica o (re) analizar ficheros de flujo con las mediciones de MRD por equipos de referencia.
Este artículo describe las acciones más importantes de la colección de aspirado de médula ósea para determinación de MRD en muestras clínicas - que requieren todo un equipo de expertos con tareas específicas, responsabilidades y con comunicación frecuente para la eficaz caracterización y análisis. Puesto que cada tarea es fundamental para el procedimiento, se recomienda tener sonido logística incluyendo protocolos en cada laboratorio y suficiente personal de respaldo que ha sido específicamente entrenado para la tarea. Además, puesto que hay algunos pasos relativamente subjetivos en la parte de los procedimientos (especialmente pila y LSC aberrante marcador de identificación), es esencial para las discusiones sobre el resultado final por el equipo y el informe final autorizado por un equipo de supervisores. Los esfuerzos actuales están llevando a cabo desarrollo de software de ordenador que te ayudará a estandarizar el análisis MRD (pila y LSC).
Modificación y resolución de problemas
Cada laboratorio puede tener su propio conjunto de anticuerpos que puede utilizarse para definir las diversas subpoblaciones, aunque tener una columna vertebral estandarizada de marcadores es esencial para obtener resultados comparables, como se indica en las directrices del estado del arte ELN para documento medidas de MRD anteriormente descrito. Independientemente de los marcadores solicitados hay algunas cuestiones que pueden dificultar el análisis de los resultados y deben tomarse en consideración.
Limitaciones de la técnica
La identificación de expresión aberrante de marcadores de pila y LSC primero es evaluada en el diagnóstico y seguimiento en el tiempo (durante y después de la terapia) para una caracterización precisa del fenotipo MRD. Mientras que sobre el 95% de los pacientes pueden ser evaluado mediante pila o LSC (o ambos), todavía algunos pacientes tienen no LAIPs definidos o no CD34 + CD38-LSCs presentan CD34 negativo ráfagas o tienen una muestra falta de diagnóstico. En estos casos, vale la pena probar y medir MRD con un panel de anticuerpos tan amplios como el número de celdas disponibles permite y luego selecciona la más confiable (dando la distinción más fuerte de las células leucémicas) pila. Teniendo en cuenta que una proporción de pacientes que recaen en última instancia no parecen totalmente el immunophenotype de diagnóstico, debido a la heterogeneidad de la enfermedad ALD, medir un amplio panel de anticuerpos en MRD se recomienda de todos modos. Estos cambios de immunophenotypic incluyen células de la ráfaga y LSCs y han demostrado que ocurren durante la terapia16 y la enfermedad medible puede basarse en estas poblaciones próximas llamadas. En este momento sin embargo, no ha sido determinada si todas las subpoblaciones de immunophenotypic dará lugar a recaída de la enfermedad, y es por lo tanto no habitual Informe MRD a medida-terapia basada en estas células en los ensayos clínicos. Es importante tener en cuenta que el riesgo de perder LSC debido a cambios de la población se reduce por el acercamiento de un tubo en el que los más importantes marcadores define aberración son en citometría de un flujo (PE) canal14.
Importancia con respecto a los métodos existentes
El método descrito en el presente Protocolo se basa en la definición de LAIPs uno o más, que las células se siguen durante la terapia. Una desventaja de este método es que se ha recientemente demostrado que la pila puede cambiar durante la terapia. De esta forma que algunas poblaciones próximas con diferentes marcadores aberrantes pueden ser faltadas. Para evitar esto, lo mejor sería medir todos los marcadores de aberrantes en lugar de sólo los que se encuentran en el diagnóstico. Esto sería similar a lo "diferente de la normal" que es utilizado por varios laboratorios17.
Futuras aplicaciones
Recientemente, MRD ha recibido atención adicional para el nuevo diseño de ensayo clínico. En la era de las opciones de tratamiento especializado y farmacoterapia específica, el uso de MRD como una medida de resultado se reduce el tiempo necesario para establecer la eficacia clínica de nuevos tratamientos, en última instancia, lo que permite una introducción más rápida de urgencia terapéutica opciones en la clínica. La importancia de la logística adecuada y ejecución práctica de una evaluación armonizada de MRD son cruciales para el futuro éxito del tratamiento de AML como la FDA está investigando la factibilidad de uso de MRD como un endpoint sustituto en vez de la supervivencia global mide18.

Leucemia mieloide aguda (AML) es que un tumor maligno de la médula ósea caracterizado por defectos en el programa de maduración, con proliferación anormal y la acumulación de las células progenitoras mieloides, inhibición de la hematopoyesis normal y en última instancia, insuficiencia de la médula ósea . La enfermedad es altamente heterogénea en cuanto a morfología, immunophenotype, citogenética, las aberraciones moleculares y firmas de expresión génica, así como a la respuesta al tratamiento y tratamiento resultado1,2. El manejo actual incluye la quimioterapia de inducción con el objetivo de lograr la remisión completa (CR), seguida por remisión posterior al tratamiento, que es en gran medida guiado por los resultados moleculares, citogenéticos y immunophenotypic estudia y consiste ya sea en varios cursos de quimioterapia adicional o trasplante de células madre (autólogos o alogénicos)3. A pesar de tasas de remisión alta después de quimioterapia intensiva de hasta 90% supervivencia a 5 años en adultos sólo es aproximadamente 30-40%, principalmente debido al desarrollo de recidivas que son normalmente resistentes a la quimioterapia y así muy difícil de tratar. Resultado en los niños es mejor, aunque aproximadamente un tercio de la recaída también. Por lo tanto, la detección temprana de recaída inminente llenará una necesidad médica y puede orientar la terapia post remisión4.
Enfermedad residual después de terapia puede reflejar la suma de todos los diagnóstico y mecanismos/factores de resistencia post-diagnóstico; por lo tanto, su medición puede ser instrumental para guiar el tratamiento y pronóstico. La posibilidad de enfermedad residual de delimitando (antiguamente llamada enfermedad residual mínima y ahora se refiere como medibles de enfermedad residual o MRD) muy por debajo de los criterios morfológicos de 5% de blastocitos está cambiando el panorama de la clasificación de riesgo. Actualmente los dos métodos que se utilizan sobre todo para detectar la MRD son flujo cytometry y molecular-, este último se evalúa por la transcriptasa reversa PCR (RT-qPCR)5 o, aunque en una etapa prematura, por nueva generación sequencing (NGS). Muchos estudios en adultos como en niños ya demostrado que diversos enfoques MRD proporcionan información pronóstica fuerte en AML tanto después de6,de la terapia de inducción y consolidación7y una nueva definición de carga de enfermedad ( superior a CR morfológica) está ahora emergiendo8. Esto sugiere que MRD evaluados por flujo o técnicas moleculares deben ser y de hecho son ya cada vez, estándares en cada ensayo clínico en la AML.
Este manuscrito describe el procedimiento de citometría de flujo detallados para obtener una caracterización precisa y reproducible immunophenotypic de MRD en muestras de médula ósea, incluyendo la toma de muestras de médula ósea y tratamiento procedimientos anteriores citometría de flujo. La disponibilidad de muestras de médula ósea de buena calidad en el diagnóstico y seguimiento es crucial para el éxito de esta medida a través de centros clínicos y ensayos clínicos. De hecho, estas consideraciones pre-analíticas son también de los enfoques MRD de vital importancia para molecular (PCR y NGS). Para la caracterización de immunophenotypic de MRD, marcadores expresados aberrantemente se combinan con mieloide normal y marcadores del progenitor, para identificar una leucemia asociados immunophenotype (pila)9. MRD mide el resultado de muchos factores que influyen en la respuesta a la terapia, tales como resistencia intrínseca o adquirida leucemia, farmacodinamia y cinética de la terapia, la vigilancia inmune y cumplimiento. Por lo tanto, MRD es un muy fuerte parámetro pronóstico posterior al diagnóstico asociado con resultado clínico cuando dicotomizada en un nivel de corte determinado por análisis de la característica de funcionamiento de receptor (ROC). En nuestra cohorte AML adultos de HOVON 42a estudio, el nivel de corte se fija en 0,1% de glóbulos blancos de pila total células positivas. Utilizando este criterio para determinar el estado MRD positivo vs negativo, se puede identificar un grupo de pacientes que tienen una incidencia de recaída significativamente peor, supervivencia libre de recidiva y general6. Además, describimos la medición de las células de leucemia inmaduras, resistente a los medicamentos con características similares a la célula de vástago (células CD34 + CD38-leucemia o LSC), que ofrece un fuerte predictor de resultados de los pacientes10. Forma el enfoque MRD de citometría de flujo se acerca a pila y LSC. El enfoque de pila es apropiado para aproximadamente el 90% de los pacientes, mientras que el enfoque LSC puede aplicarse en alrededor del 80% de los pacientes. Juntos sobre el 95% de los pacientes pueden ser evaluado para un parámetro o ambos.
Por último, esta publicación ofrece una descripción detallada de la operación para evaluar MRD por citometría de flujo. Esto incluye: 1) armonización o estandarización de los procedimientos de muestreo de la médula ósea, dirección de transporte 2) muestra 3) Descripción detallada de la detección de células leucémicas con FACS usar varios paneles de anticuerpos incluyendo célula tubo enfoques para caracterizar el LSC, 4) máquinas de montaje de la FACS para las mediciones estandarizadas, 5) programas analíticos para mediciones de MRD y 6) programas analíticos para la detección de la LSC.
Nuestro objetivo es mostrar todas las facetas del procedimiento incluida la preparación de la muestra puesto rara vez se discute si bien es un tema importante para la calidad del resultado final. Biopsia y aspiración de médula ósea son procedimientos clínicos utilizados para evaluar las células hematopoyéticas en la médula ósea. Estos se realizan con un conteo sanguíneo completo (CSC) y un frotis de sangre. El método óptimo para la aspiración de médula ósea es crucial para la diagnosis exacta y el seguimiento para la medición de MRD. Además, un aspirado de médula ósea exitoso debe contener suficientes células para realizar el análisis de flujo de pila y LSC (células viables por lo menos 10 millones). Aquí, describimos el método para realizar una aspiración de médula ósea y ofrece una guía, que debe resultar en adecuada celda muestreo (y límite de la posibilidad de hemodilución) necesarios para la investigación adicional y precisa el diagnóstico. Estas consideraciones pre-analíticas son también de los enfoques MRD de vital importancia para molecular (PCR y NGS). Todas las muestras de immunophenotyping deben procesarse preferencial dentro de las 24 h de colección. Aunque no recomendable, muestras de sangre periférica y médula ósea pueden todavía ser procesadas y analizadas conservado hasta 72 h a temperatura ambiente. Además, todas las manipulaciones con el material deben realizarse en condiciones estériles, para permitir que la criopreservación de células estériles para la posterior evaluación de la investigación/calidad etcetera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Criterios de respuesta en la leucemia mieloide aguda (LMA) ha sido recientemente restablecido, con examen morfológico para determinar si los pacientes lograron remisión completa (CR). Aproximadamente la mitad de los pacientes adultos que ingresaron CR se recaída dentro de 12 meses debido a la consecuencia de las células AML residual en la médula ósea. La cuantificación de estos restantes células de la leucemia, conocidas como enfermedad residual mínima o medible (MRD), puede ser un biomarcador robusto para la predicción de estas recidivas. Por otra parte, el análisis retrospectivo de varios estudios ha demostrado que la presencia de MRD en la médula ósea de los pacientes AML se correlaciona con la supervivencia pobre. No sólo es la población leucémica, reflejado por células albergar una leucemia asociados fenotipo inmunológico (pila), asociado al resultado clínico, pero también lo es la subpoblación de inmaduros baja frecuencia de células madre de leucemia (LSC), los cuales pueden ser seguimiento a través de citometría de flujo MRD o MRD-como enfoques. La disponibilidad de ensayos sensibles que permiten la detección de células de la leucemia residual (stem) en base de características específicas de la enfermedad o enfermedades asociadas (marcadores moleculares anormales o aberrantes immunophenotypes) tiene evaluación de MRD drásticamente mejorada en la AML. Sin embargo, dada la inherente heterogeneidad y complejidad de esta afección como enfermedad, métodos para el muestreo de la médula y realizar análisis de MRD y LSC deben armonizarse siempre que sea posible. En este manuscrito que se describe una metodología detallada para el aspirado de médula ósea adecuado de muestreo, transporte, procesamiento para la evaluación de la citometría de flujo óptimo de varios colores y estrategias para evaluar el indicador MRD y LSC para ayudar en la toma de decisiones terapéuticas que bloquean la muestra para los pacientes AML.

En el 90% de los pacientes AML se puede identificar por lo menos una pila. Para generar los porcentajes exactos de pila + las células de las células primitivas de la ráfaga en la diagnosis, el ajuste apropiado de la puerta de explosión es crucial y necesita verificación como visualizado en la figura 3. Un ejemplo de cada paciente que un tipo específico de aberración en las primitivas células de CD34 + se visualiza en la figura 5. Para medición de MRD en el seguimiento, el anteriormente definido pila + células cerradas y define como porcentaje de pila + las células de los glóbulos blancos. Por lo tanto, el ajuste de esta puerta es crucial para lograr los resultados correctos de MRD. La figura 6 muestra un paciente que permanece en remisión completa y un paciente que después de tener resultados positivos de la MRD (≥ 0.1%) de las recaídas después del segundo ciclo de la terapia de inducción.
El protocolo actual sólo es adecuado para definir las células madre en células CD34 +, puesto que la caracterización exhaustiva de este compartimento ha demostrado que el CD38-población alberga la célula de vástago más potente como fracción. Para separar el LSC de la HSC dentro de esta fracción, se usan marcadores adicionales. Los marcadores más a menudo seleccionados para distinguir LSC son CD45RA y el canal de combi que 6 marcadores específicos de LSC con PE. De acuerdo con otras evaluaciones clínicas, un nivel de corte de ≥ 0.004% se definió como positivo de LSC y se asoció con peor supervivencia en la diagnosis mientras que un nivel de corte de 0,0001% se utilizó en el siga-up10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figura 1 : Frotis de médula ósea. Donante A) sano y paciente B) AML (subtipo FAB 5). Tinción de Giemsa en 100 aumentos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figura 2 : Corregir el material de embalaje para líquidos biológicos. Más detalles sobre las normas y reglamentos de transporte de fluidos biológicos pueden encontrarse en el sitio15 de los centros de Control y prevención de enfermedades. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figura 3 : Estrategia para la definición de células de la ráfaga que bloquean. A) compuerta CD45dim, B) compuerta CD34 + blastos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figura 4 : Bloquear linfocitos. A) células azul son WBC se muestra en la trama de la FSC/SSC, células B) verdes son linfocitos caracterizados por CD45alta/SSCbaja, C) se muestran ejemplos de negatividad para CD34, D) negatividad para CD117 y la E) negatividad para CD13, F) los diferentes tipos de células en un árbol de población Resumen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figura 5 : LAIPs en la diagnosis AML. A) pila basada en cruz linaje aberración (CD7 en células expresan CD33), B) pila basada en diferenciación asincrónica (CD11b en células expresan CD13), C) pila basada en sobreexpresión en comparación con las células normales (CD34muy alta de CD13 expresando las células), D). PILA basada en underexpression en comparación con las células normales (HLA-DRbajo de CD33 expresando las células). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figura 6 : Pila seguido durante la terapia. Definición A) pila al diagnóstico (CD34 + / CD13 + / CD33-) y pérdida de la pila durante el seguimiento en un paciente que permaneció en remisión completa continua, definición de la pila B) en el diagnóstico (CD117 + / CD7 + / CD33 +) y persistencia de la pila durante el seguimiento en un paciente que recayó. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figura 7 : Célula de vástago que bloquean. Un) Gating de la diferentes CD34 + / CD38 poblaciones basan en granos (CD38baja está por debajo del borde superior de los granos, mientras que el CD38 se definen como las células negativas verdadera representación del LSCmuy baja y se encuentran debajo de la mediana de los granos), B) dos ejemplos de pacientes con distinción entre HSC y LSC en la carta recordativa basada en CD45RAneg y CD45RApos expresión. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo suplementario 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargamos este archivo.</a>
Archivo suplementario 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargamos este archivo.</a>
Archivo suplementario 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargamos este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...