Name: assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease
Uploaded: 2017-11-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la « Fondazione Neuromed » et financé par le ministère italien de la santé « Ricerca Corrente » de V.M.

toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Conseil d’examen du soin de Animal IRCCS Neuromed et &#34; Istituto Superiore di Sanità &#34; (numéro de permis : 1163/2015-PR) et étaient conformes aux lignes directrices de l’Union européenne Directive 2010 / 63/EU pour l’expérimentation animale.
 1. préparation de la Solution FITC-albumine pour être injecté dans la veine jugulaire Remarque : toutes les expériences ont été contr...

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	<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).</li><li>Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+blood-brain+barrier.">Anatomy and physiology of the blood-brain barrier.</a> Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).</li><li>Moretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+disorders+of+the+developing+brain.">Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain.</a> Front Neurosci. 9, 40 (2015).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+human+Greatwall+results+in+G2+arrest+and+multiple+mitotic+defects+due+to+deregulation+of+the+cyclin+B-Cdc2/PP2A+balance.">Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).</li><li>Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+after+embolic+stroke+in+rats+occurs+without+ultrastructural+evidence+for+disrupting+tight+junctions.">Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions.</a> PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).</li><li>Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. 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La technique que nous décrivons ici est principalement utile pour détecter les fuites BBB dans des conditions de maladie cérébrale. Dysfonctionnement BBB gagne l’attention comme une caractéristique commune des divers troubles neurologiques4. Précédemment, nous avons utilisé cette approche pour décrire le dérangement au début de l’intégrité de la BBB dans un modèle murin d’une maladie neurodégénérative rare comme HD6.
Cette ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author&#39;s names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione

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Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

L’homéostasie dans le système nerveux central (CNS) est une condition sine qua non pour la bonne communication et la fonction des cellules neuronales. Le parenchyme de la CNS est hermétiquement bouclé de la périphérie de l’endothéliale – barrière hémato encéphalique (BHE), qui représente l’interface entre le cerveau et le sang périphérique et joue un rôle essentiel dans la diaphonie entre ces deux districts1 ,2. La BHE est un complexe et dynamique structure tridimensionnelle composée principalement de spécialisées micro-navire cellules endothéliales (CE) reliés entre eux par l’intermédiaire de complexes de jonction intercellulaires - jonctions serrées (TJs) - et entouré de péricytes, neurone terminaisons et astrocyte pied processus1,2.
Dans des conditions physiologiques, la très faible perméabilité de la BHE intacte assure le strict règlement du transport des nutriments et autres molécules dans et hors du cerveau et fournit le système nerveux central avec une protection unique contre les changements qui se produisent dans la composition du sang susceptibles d’influencer l’activité neurale et contre potentiel périphérique insulte1,2,3.
Perturbation de l’intégrité BBB et sa perméabilité améliorée sait depuis longtemps pour constituer un élément clé pour beaucoup neurologiques et neurodégénératives troubles4 , y compris la maladie de Huntington (MH)5,6, toutefois , si un tel dysfonctionnement est un phénomène causal ou un événement de propagation au cours de la maladie est encore peu clair. Le moment de la rupture BBB aussi reste insaisissable, cependant, des preuves de notre groupe et autres nouvelles indique que perturbé BBB intégrité ne représente pas un événement tardif dans la progression de la maladie, mais plutôt une étape précoce6,7 , 8, qui peut avoir des conséquences à long terme.
Dans cette optique, il est important de révéler précocement rupture de BBB neurodégénérescence afin d’élaborer des stratégies utiles pour prédire la progression de la maladie et des lésions cérébrales et de développer des interventions alternatives et plus ciblées capables d’avec succès atténuer les conséquences cliniques de cette perturbation. L’imagerie fiable de déficience de BBB est donc d’une importance majeure dans la recherche expérimentale et prise en charge clinique des maladies du cerveau.
Dans cet article, nous décrivons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la perméabilité BBB dans un modèle murin de HD à l’aide de la masse moléculaire élevée fluorescéine isothiocyanate-albumine marquée (FITC-albumine). Extravasation de FITC-albumine, qui normalement ne peut pas traverser la barrière, dans le parenchyme du cerveau a été mesurée comme indice de fuite BBB. Cette technique est facilement adaptable à des rats et d’autres pathologies caractérisées par cerebrovasculature déficience9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9771-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAb anti-Laminin</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 anti-rabbit made in goat</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>AP132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips 24 X 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific (DIAPATH)</td>
			<td>61050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound</td>
			<td>Bio Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Media</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>H-1500</td>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iNSu/Light Insulin Disposible Syringe</td>
			<td>RAYS Health &#38;Safety</td>
			<td>INS1ML26G13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>304000</td>
			<td>Needle for Insulin disposible Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#22 Disposable Scalpel blads</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris scissors 10.5 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5745 45&#176; 0.10 x 0.06 mm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps 10 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical patch</td>
			<td>Medicalis</td>
			<td>34788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable towel drape</td>
			<td>Dispotech</td>
			<td>TVO50VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ 745 T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Illuminator LED light (C-FLED2)</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>1003167</td>
			<td>Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ni-U Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>932162</td>
			<td>Epifluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Ri2</td>
			<td>Microscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intenslight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td>Microscope lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR 4.40.00</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Gemei</td>
			<td>GM-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease

Perturbation de l’intégrité de la barrière hémato - encéphalique (BHE) est une caractéristique commune de différentes maladies neurologiques et neurodégénératives. Bien que l’interaction entre perturbée BBB homéostasie et la pathogenèse des maladies du cerveau a besoin d’une enquête plus approfondie, le développement et la validation d’une procédure fiable pour détecter avec précision les modifications BBB peuvent être crucial et représentent un outil utile pour prédire la maladie potentiellement la progression et le développement ciblé des stratégies thérapeutiques.
Nous présentons ici une procédure simple et efficace d’évaluation de fuite BBB dans une affection neurodégénérative comme ça qui se produisent dans un modèle murin préclinique de la maladie de Huntington, dans lesquels tout défaut de la perméabilité du BBB est clairement décelable précocement dans la maladie. Plus précisément, le poids moléculaire élevé l’isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine, qui est capable de traverser la BHE uniquement lorsque ce dernier est altérée, est parfaitement infusée dans une veine jugulaire de souris et de sa distribution dans les districts de vasculaires ou parenchymateuses est alors déterminé par microscopie à fluorescence.
Accumulation du vert fluorescent-albumine dans le parenchyme du cerveau fonctionne comme un indice de perméabilité BBB aberrant et, lorsque quantifiée à l’aide de logiciels de traitement d’Image J, est signalée comme l’intensité de Fluorescence verte.

Bonne infusion de FITC-albumine dans les résultats de la veine jugulaire dans l’extravasation du traceur fluorescence verte de la circulation sanguine dans le cerveau de parenchymawhen que la BHE est compromise6. Dans des conditions physiologiques, distribution d’albumine fluorescent infusée est restreinte à l’intérieur des vaisseaux du cerveau et aucun signal dans le parenchyme de domaine et/ou cerveau périvasculaires environnant n’est détectable (<s...

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Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.

Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

The overall goal of this procedure is to assess the brain-blood barrier permeability in a mouse model of degenerative disorder by intrajugular injection of FITC-labeled albumin. This method can help answer the key questions in the study of brain homeostasis. It can be particularly useful to investigate any possible link between blood-brain barrier damage and neurodegeneration.The main advantage of this technique is that it is fast and easy to perform and can be applied, also, to larger animal models and to other neuro-pathological settings. Demonstrating the surgical procedure of intrajugular injection of FITC-albumen will be Luca Capocci. Salvatore Castaldo will demonstrate the histological sectioning of a brains.And Enrico Amico will demonstrate the procedure for micrograph acquisition. Begin by preparing FITC-albumen solution by dissolving FITC-albumen powder in phosphate buffered saline at 10 milligrams per milliliter. Lay out the autoclaved surgical instruments.Clean the surgical bench with 70%ethanol and place a surgical sterile disposable drape. Then set up the operating stereo microscope. After anesthetizing the mouse with an intraperitoneal injection of an appropriate does of ketamine xylazine solution, monitor animal sedation by giving a gentle toe pinch and ensuring the absence of the withdrawal reflex.Place the anesthetized mouse in a face-up supine position and fix the four legs and the tail on the surgical workbench with adhesive tape. After the mouse is secured, carefully shave the appropriate surgical margin on the neck and disinfect it with povidone-iodine solution in 70%ethanol. Dry the exposed shaved surface with cotton swabs.Next, after making a 1.5 centimeter long longitudinal incision in the mid-clavicular line, starting midway on the thorax and extending to just below the neck, carefully stretch apart connective tissue with forceps under microscopic observation to expose the external jugular vein. Ensure sufficient space on the right and on the left of the jugular vein to facilitate the insertion of the 30 and a half gauge needle for the infusion of the FITC-albumen solution. Inject 100 microliters of 10 milligrams per milliliter FITC-albumen in the right jugular vein over three minutes.This is the most critical step during the procedure. Incorrect insertion of the needle can cause irreversible damage of the vein wall and compromise the entire experiment. Fifteen minutes after injection, after euthanizing the mouse by decapitation, rapidly remove the brain from the skull and immerse it in a volume of pre-chilled isopentane, that is ten times that of the brain, for 15 minutes.Move the isopentane frozen brain into a pre-chilled tube and store it in a 80 degrees Celsius freezer until histological sectioning. Embed frozen brain in optimal cutting temperature compound prior to cryostat sectioning. Cut the brain into 20 micron thick sections with a cryostat and mount them onto microscope glass slides.Perform the FITC-albumin laminin co-staining by using a specific anti-laminin antibody, as previously described. Cover slip slides with mounting medium containing DAPI and leave the slide to dry overnight at four degrees Celsius in the dark. The next day, observe the fluorescence staining under a fluorescence microscope at 20 times magnification, equipped with both FITC and Cy3 filters.Turn on the fluorescence lamp about 10 minutes before use. Turn on the microscope, the connected computer and the digital camera. Run the image analysis software.Use the appropriate objective for optimal signal collection and spatial resolution and select appropriate filters. Acquire a minimum of four, 24-bit color exposures per brain slice. Analyze the fluorescence intensity for each single channel, using the freely available ImageJ software.The following representative fluorescence micrographs of brain cryosections show differential distribution of green fluorescent albumin under both physiological and pathological conditions. The red staining, shown here, represents the vascular marker, laminin, under physiological conditions and under conditions of blood-brain barrier compromise. These merged images show co-localization of green fluorescent albumin and laminin, along with DAPI staining of nuclei in the intact and compromised blood-brain barriers.This graph displays the quantification of the green fluorescence emitted by FITC-albumin, which is reported as the green fluorescence intensity in both healthy and compromised conditions. While attempting this procedure, it's important to remember to freshly prepare each single reagent and predispose the surgical bench. After watching this video, you may have a good understanding of how to assess the permeability of the blood-brain barrier in an animal model of neurodegenerative disease, by measuring the affixation of the green fluorescent albumin into brain parenchyma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Les méthodes de l&#39;administration par voie intraveineuse auto dans un modèle de souris

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Recherche

Neurosciences

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Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Les tests olfactifs pour les modèles murins de maladies neurodégénératives

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

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