Name: assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease
Uploaded: 2017-11-08T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von "Fondazione Neuromed" unterstützt und gefördert durch das italienische Gesundheitsministerium "Ricerca Corrente", Valašské

alle Vorgänge an Tieren wurden genehmigt durch das IRCCS Neuromed Animal Care Review Board und &#34; Istituto Superiore di Sanità &#34; (Anzahl zu ermöglichen: 1163/2015-PR) und wurden nach den Vorgaben der EU-Richtlinie 2010 / 63/EU für Tierversuche.
 1. Vorbereitung der FITC-Albumin-Lösung in Halsschlagader injiziert werden Hinweis: alle Experimente wurden durchgeführt in manifest (11 - Wochen alten) HD R6/2-Mäuse und in Alter und Geschlecht abgestimmt Wild...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice.">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. (9), e404 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>McCloy, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+human+Greatwall+results+in+G2+arrest+and+multiple+mitotic+defects+due+to+deregulation+of+the+cyclin+B-Cdc2/PP2A+balance.">Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).</li><li>Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+after+embolic+stroke+in+rats+occurs+without+ultrastructural+evidence+for+disrupting+tight+junctions.">Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions.</a> PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).</li><li>Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. 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Das Verfahren, die, das wir hier beschreiben, eignet sich in erster Linie zur Erkennung von BBB Leckage unter Erkrankungen des Gehirns. BBB-Dysfunktion gewinnt Aufmerksamkeit als ein gemeinsames Merkmal der vielfältigen neurologische Störungen4. Wir früher diesen Ansatz um die frühe Störung der BBB Integrität in einem Mausmodell der eine seltene Neurodegenerative Erkrankung wie HD6beschreiben.
Diese Methode nutzt die relative Einfachheit un...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author&#39;s names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione

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Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Homöostase innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) ist eine Voraussetzung für die richtige Kommunikation und Funktion der neuronalen Zellen. Das CNS-Parenchym ist fest von der Peripherie durch die endotheliale Blut - Hirn-Schranke (BBB), abgedichtet, stellt die Schnittstelle zwischen den peripheren Blutkreislauf und dem Gehirn dar und spielt eine Schlüsselrolle in der Übersprechen zwischen diese beiden Bezirke1 ,2. Die BBB ist eine komplexe und dynamischer dreidimensionale Struktur hauptsächlich bestehend aus spezialisierten Mikro-Schiff Endothelzellen (ECs) durch interzelluläre Knoten komplexe - tight Junctions (TJs) - miteinander verknüpft und umgeben von Perizyten, Neuron Endungen und Astrozyten Fuß Prozesse1,2.
Unter physiologischen Bedingungen die extrem geringe Durchlässigkeit der intakten BBB sorgt für die strenge Regelung des Transports von Nährstoffen und anderen Molekülen in und aus dem Gehirn und ZNS bietet einen einzigartigen Schutz vor Veränderungen in der Zusammensetzung des Blutes, die neuronalen Aktivität beeinflussen könnten und gegen Potenzial peripheren Beleidigungen1,2,3.
Störung des BBB Integrität und seine verbesserte Durchlässigkeit ist seit langem bekannt, bilden ein wesentliches Merkmal für viele neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen4 einschließlich der Huntington-Krankheit (HD)5,6, jedoch , ob solch eine Funktionsstörung eine ursächliche Phänomen ist oder ein vermehrenden Ereignis im Verlauf der Erkrankung noch unklar ist. Das Timing der BBB Aufteilung bleibt auch schwer, zeigt jedoch Anzeichen von unserer Fraktion und anderen gestörten BBB Integrität dar kein Ende Ereignis in der Progression der Erkrankung, sondern eher ein erster Schritt6,7 , 8, die langfristige Auswirkungen haben kann.
Mit diesem Hintergrund ist es wichtig, altklug BBB Zusammenbruch der Neurodegeneration zu offenbaren, um Strategien nützlich, Krankheitsverlauf und Hirnschäden vorherzusagen und alternative und gezieltere Interventionen in der Lage, erfolgreich zu entwickeln Abschwächung der klinischen Folgen solch einer Unterbrechung. Zuverlässige Darstellung der BBB Beeinträchtigung ist daher von großer Bedeutung in der experimentellen Forschung und klinische Behandlung von Erkrankungen des Gehirns.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein erfolgreiches und einfaches Verfahren für die Bewertung der BBB Permeabilität in einem HD-Maus-Modell mithilfe der hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet-Albumin (FITC-Albumin). Extravasation von FITC-Albumin, die normalerweise die Schranke in das Gehirn Parenchym überqueren kann nicht gemessen wurde als Index der BBB Leckage. Diese Technik ist leicht anpassbar an Ratten und anderen pathologischen Zuständen zeichnet sich durch Cerebrovasculature Beeinträchtigung9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9771-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAb anti-Laminin</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 anti-rabbit made in goat</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>AP132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips 24 X 50 mm</td>
			<td>Thermo Scientific (DIAPATH)</td>
			<td>61050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound</td>
			<td>Bio Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Media</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>H-1500</td>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iNSu/Light Insulin Disposible Syringe</td>
			<td>RAYS Health &#38;Safety</td>
			<td>INS1ML26G13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>304000</td>
			<td>Needle for Insulin disposible Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#22 Disposable Scalpel blads</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris scissors 10.5 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5745 45&#176; 0.10 x 0.06 mm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps 10 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical patch</td>
			<td>Medicalis</td>
			<td>34788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable towel drape</td>
			<td>Dispotech</td>
			<td>TVO50VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>SMZ 745 T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Illuminator LED light (C-FLED2)</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>1003167</td>
			<td>Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ni-U Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>932162</td>
			<td>Epifluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Ri2</td>
			<td>Microscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intenslight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td>Microscope lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR 4.40.00</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Gemei</td>
			<td>GM-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease

Störung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) Integrität ist ein gemeinsames Merkmal für verschiedene neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen. Obwohl das Zusammenspiel gestört, BBB-Homöostase und die Pathogenese der Erkrankungen des Gehirns weiteren Untersuchungen benötigt, können die Entwicklung und Validierung eines zuverlässigen Verfahrens zum BBB Veränderungen genau zu erfassen entscheidend sein und ein nützliches Werkzeug für die potenziell Vorhersage Krankheit gezielt Fortschritt und Entwicklung von Therapiestrategien.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung BBB Leckage in einer neurodegenerativen Zustand wie das Auftreten in einem präklinischen Mausmodell der Huntington-Krankheit, in denen Mängel in der Durchlässigkeit der BBB altklug im eindeutig nachweisbar sind die Krankheit. Insbesondere die hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin, das ist in der Lage, die BBB überqueren Sie nur, wenn letztere beeinträchtigt wird, ist akut in eine Maus Halsschlagader und deren Verteilung in den Bezirken Gefäß- oder parenchymatösen infundiert richtet sich dann nach Fluoreszenz-Mikroskopie.
Ansammlung von Grün fluoreszierend-Albumin in der Anwesenheit von fungiert als einen Index von aberranten BBB Permeabilität und beim quantitated mit Bild J-Processing-Software, wird berichtet, wie grüne Fluoreszenzintensität.

Korrekte Infusion von FITC-Albumin in die Halsschlagader-Ergebnisse in der Extravasation der grünen Fluoreszenz Tracer aus dem Blutkreislauf in das Gehirn-Parenchymawhen ist die BBB gefährdet6. Unter physiologischen Bedingungen, Verteilung der infundierten fluoreszierende Albumin beschränkt sich auf das Innere der Blutgefäße des Gehirns und kein Signal in die umliegenden perivaskuläre Bereich und/oder Gehirn Parenchym ist nachweisbar (Abb...

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Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.

Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

The overall goal of this procedure is to assess the brain-blood barrier permeability in a mouse model of degenerative disorder by intrajugular injection of FITC-labeled albumin. This method can help answer the key questions in the study of brain homeostasis. It can be particularly useful to investigate any possible link between blood-brain barrier damage and neurodegeneration.The main advantage of this technique is that it is fast and easy to perform and can be applied, also, to larger animal models and to other neuro-pathological settings. Demonstrating the surgical procedure of intrajugular injection of FITC-albumen will be Luca Capocci. Salvatore Castaldo will demonstrate the histological sectioning of a brains.And Enrico Amico will demonstrate the procedure for micrograph acquisition. Begin by preparing FITC-albumen solution by dissolving FITC-albumen powder in phosphate buffered saline at 10 milligrams per milliliter. Lay out the autoclaved surgical instruments.Clean the surgical bench with 70%ethanol and place a surgical sterile disposable drape. Then set up the operating stereo microscope. After anesthetizing the mouse with an intraperitoneal injection of an appropriate does of ketamine xylazine solution, monitor animal sedation by giving a gentle toe pinch and ensuring the absence of the withdrawal reflex.Place the anesthetized mouse in a face-up supine position and fix the four legs and the tail on the surgical workbench with adhesive tape. After the mouse is secured, carefully shave the appropriate surgical margin on the neck and disinfect it with povidone-iodine solution in 70%ethanol. Dry the exposed shaved surface with cotton swabs.Next, after making a 1.5 centimeter long longitudinal incision in the mid-clavicular line, starting midway on the thorax and extending to just below the neck, carefully stretch apart connective tissue with forceps under microscopic observation to expose the external jugular vein. Ensure sufficient space on the right and on the left of the jugular vein to facilitate the insertion of the 30 and a half gauge needle for the infusion of the FITC-albumen solution. Inject 100 microliters of 10 milligrams per milliliter FITC-albumen in the right jugular vein over three minutes.This is the most critical step during the procedure. Incorrect insertion of the needle can cause irreversible damage of the vein wall and compromise the entire experiment. Fifteen minutes after injection, after euthanizing the mouse by decapitation, rapidly remove the brain from the skull and immerse it in a volume of pre-chilled isopentane, that is ten times that of the brain, for 15 minutes.Move the isopentane frozen brain into a pre-chilled tube and store it in a 80 degrees Celsius freezer until histological sectioning. Embed frozen brain in optimal cutting temperature compound prior to cryostat sectioning. Cut the brain into 20 micron thick sections with a cryostat and mount them onto microscope glass slides.Perform the FITC-albumin laminin co-staining by using a specific anti-laminin antibody, as previously described. Cover slip slides with mounting medium containing DAPI and leave the slide to dry overnight at four degrees Celsius in the dark. The next day, observe the fluorescence staining under a fluorescence microscope at 20 times magnification, equipped with both FITC and Cy3 filters.Turn on the fluorescence lamp about 10 minutes before use. Turn on the microscope, the connected computer and the digital camera. Run the image analysis software.Use the appropriate objective for optimal signal collection and spatial resolution and select appropriate filters. Acquire a minimum of four, 24-bit color exposures per brain slice. Analyze the fluorescence intensity for each single channel, using the freely available ImageJ software.The following representative fluorescence micrographs of brain cryosections show differential distribution of green fluorescent albumin under both physiological and pathological conditions. The red staining, shown here, represents the vascular marker, laminin, under physiological conditions and under conditions of blood-brain barrier compromise. These merged images show co-localization of green fluorescent albumin and laminin, along with DAPI staining of nuclei in the intact and compromised blood-brain barriers.This graph displays the quantification of the green fluorescence emitted by FITC-albumin, which is reported as the green fluorescence intensity in both healthy and compromised conditions. While attempting this procedure, it's important to remember to freshly prepare each single reagent and predispose the surgical bench. After watching this video, you may have a good understanding of how to assess the permeability of the blood-brain barrier in an animal model of neurodegenerative disease, by measuring the affixation of the green fluorescent albumin into brain parenchyma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Methoden zur intravenösen Selbstverwaltung in einem Maus-Modell

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Riech Assays für Mausmodelle für Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Induktion und Bewertung von Levodopa-induzierten Dyskinesien in einem Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

Verstopfungstests bei Drosophila-Fliegen

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

Autor im Rampenlicht: Erforschung nicht-motorischer Symptome bei der Parkinson-Krankheit 

Messung von Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...