Name: an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

وأيده هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (21435008 و 21327006 إلى الأب)، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB14030200 إلى الأب).

1-الأعمال التحضيرية
<ol><li>
تعد الحل من 1.0 مم PD0325901 (مثبط لمجاهدى خلق) ومم 3.0 CHIR99021 (مثبط GSK3).
	<ol>
<li>تزن 2 مغ PD0325901 وإضافة مل 4.15 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.</li>
		<li>تزن 2 مغ CHIR99021 وإضافة مل 1.43 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.</li>
		<li>إعادة تشكيل التالية، تخزين مختبرين (50 ميليلتر/أنبوب في أنابيب PCR م...

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells.">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo.">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3.">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation.">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li><li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO.">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li><li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals.">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li><li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+modulates+NF&#954;B+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal/stem+cells.">Minocycline modulates NF&#954;B phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos.">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine:+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites.">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li><li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li><li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells.">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li><li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li><li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency.">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li><li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14:+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming.">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+in+the+embryo+and+in+culture.">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li></ol>

وفي هذا العمل، أثبتنا طريقة جديدة للجمع بين الرأسمالي و PD0325901 للحفاظ على خلايا الفأر ES في حالة غير متمايزة وهيبوميثيلاتيد، الذي تم التوصل إليه قبل إجراء تعاوني لتعزيز demethylation DNA بالاستثمار الرأسمالي، وقمع حيثياته الحمض النووي مثلايشن التي PD0325901. وعلاوة على ذلك، أظهرت الماوس دإط الخلا...

دإط الخلايا نشأت من ICM من الكيسة1. في حالة بلوريبوتينسي الخلايا ويمكن أن تشكل جميع الأنساب الجسدية و خلايا germline2. إنشاء خلايا ES يوفر الفرصة للتحقيق في تطوير العمليات في المختبر ويمكن أن تولد خلايا ذات الأهمية الطبية للطب التجديدي استناداً على بلوريبوتينسي3.
إنشاء فريقين يحملني خطوط الخلايا الماوس وفاق في عام 1981 وعندما كانت استزراع الخلايا المشتقة من الأجنة الماوس المبكر في مصل الدم البقري الجنين (FBS)-تتضمن المتوسطة مع الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) كتغذية طبقة1،4 . تم إبطال ميتوتيكالي ميفس وكانت تزرع مسبقاً في الأطباق قبل استزراع خلايا ES. تقديم الدعم لمرفق خلية الماوس ES ميفس وإنتاج عوامل النمو لتعزيز نشر وقمع التمايز5، بينما يقدم FBS العوامل التغذوية الأساسية والهرمونات لتكاثر الخلايا. بينت الدراسات اللاحقة أن ليف تنتجها الخلايا المغذية سيتوكين رئيسي للذاتي تجديد وصيانة بلوريبوتينسي في الماوس دإط الخلايا، وإضافة ليف في المتوسط يمكن أن تكون بديلاً لتغذية الخلايا6. في الوقت الراهن، الاكتفاء الماوس دإط الخلايا في المتوسط FBS/ليف على مغذيات لا يزال الأسلوب القياسي اعتمده العديد من الباحثين. ومع ذلك، تنشأ بعض المشاكل مع هذا النهج الثقافة الكلاسيكية. أولاً، تغذية الخلايا تفرز عوامل الزائدة وغير المنضبط وقد يسبب التلوث المسببة للمرض7. لتجنب هذا التدخل، وطلاء سطح الأطباق مع الجيلاتين وإضافة ليف في المحتوية على مصل المتوسطة أساليب بديلة للحفاظ على الماوس دإط الخلايا دون تغذية طبقة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يحمل الماوس دإط الخلايا نمت تحت ظروف المصل/ليف المورفولوجية عدم التجانس في السكان خلية وحتى في مستوى التعبير من العوامل المتصلة بلوريبوتينسي8. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن عوامل النسخ الأساسية المتصلة بلوريبوتينسي (بما في ذلك SOX2 ونانج OCT4) يمكن الحفاظ على ظروف المصل/ليف، بلوريبوتينسي عن طريق الآنف و WNT الإشارات؛ ومع ذلك، خصوصا، أنها أيضا تنشيط إشارة عامل النمو (صندوق الأجيال القادمة) تنتجها الخلايا الليفية لتحريك التمايز8. بسبب العمل المزدوج المتناقض لعوامل النسخ الأساسية، تقديم الماوس دإط الخلايا المستزرعة في المصل التغايرية، تتألف من السكان للتبادل اثنين، واحد مماثلة لمؤسسة أي سي أم وأخرى تشبه الدولة epiblast معبي8. وعلاوة على ذلك، الماوس دإط الخلايا في مصل الدم يحمل غالباً ما هايبرميثيليشن العالمي9، بينما ICM وبجكس في حالة هيبوميثيلاتيد عالمية، التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي10.
وهناك طلب كبير لتطوير أساليب جديدة لاستزراع خلايا الفأر ES. وقد أقيمت عدة بروتوكولات تحسن منذ عام 200311 ولكن لا تزال هناك بعض القيود وأوجه القصور7. منذ عام 2008 بالجمع بين استخدام اثنين كيناز جزيء صغير مثبطات، PD0325901 (مثبط للبروتين المنشط mitogen كيناز (MAPK)/ينظم إشارة خارج الخلية كيناز (إيرك) (مجاهدي خلق)) و CHIR99021 (مثبطات سينثاز الجليكوجين كيناز 3 (GSK3))، في ن2ب27 المتوسطة مع الآنف ودون المصل إلى فتح آفاق جديدة للماوس تثقيف دإط الخلايا12. هذه الوسيلة المعرفة الجديدة تتميز باستعمال مثبطات اثنين (2i). دإط الماوس الخلايا المستزرعة في المتوسط 2 طاء/ليف أكثر تجانساً في الخلية السكان والتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي. وبالإضافة إلى ذلك، أن الماوس 2 طاء/ليف-مثقف دإط الخلايا يحمل هيبوميثيليشن الحمض النووي على الصعيد العالمي، وهو أقرب إلى الخلايا مثل ICM9،13. ومع ذلك فقد الثقافة 2 طاء عيوبها. PD0325901 CHIR99021 غير قابلة للذوبان في الماء، وعموما يتم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])-على أساس حل الأسهم لإضافتها في الثقافة المتوسطة. وقد أظهرت الدراسات أن طويل الأجل ويمكن أن يؤدي التعرض لجرعة منخفضة من الخلايا إلى [دمس] إلى سيتوتوكسيسيتي14.
هنا، يمكننا استخدام المركبين جزيء صغير ووضع أسلوب ثقافة جديدة للماوس دإط الخلايا. الأسلوب الثقافة رواية يجمع بين المانع الرأسمالي ومجاهدي خلق PD0325901 النهوض هيبوميثيليشن الحمض النووي بسرعة وفعالية على مستوى مماثل من PGC، اسمه كبروتوكول تثقيف Vc/PD0325901. معرض التجانس في مورفولوجيا الخلايا ES الماوس في Vc/PD0325901--أضيفت المتوسطة المحتوية على مصل وهي مستمرة في حالة الأرض. بالمقارنة مع الثقافة 2 طاء، الماوس دإط الخلايا المزروعة تحت ظروف Vc/PD0325901 يحمل أسرع حركية demethylation الحمض النووي ويمكن أن تصل إلى مستوى هيبوميثيليشن مماثلة لتلك التي PGC. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام مثبط واحد (PD0325901) يقلل كمية المدخلات [دمس] في المتوسط بالمقارنة مع تلك المستخدمة في 2i (PD0325901/CHIR99021)، ويقلل من الضرر للخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum Australia source</td>
			<td style="width:205px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">35-076-CV</td>
			<td style="width:251px;">Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high glucose</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30022</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5493</td>
			<td>Cells rinse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypsin</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30042</td>
			<td>Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gelatin</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">48722</td>
			<td>Dishes coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">vitamin C</td>
			<td style="width:205px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">XW00508171</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Bioscience water purification systemr</td>
			<td style="width:205px;">Purelab</td>
			<td style="width:119px;">Ultra</td>
			<td>Ultra water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Cell freezing medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuger</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5427R</td>
			<td>DNA and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">43815</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td>Genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Determination of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf intestinal phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0290</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0303</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">snake venom phosphodiesterase I</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4506</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanosep 3K Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td style="width:119px;">OD003C35</td>
			<td>filtration of digested DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1290 UHPLC system</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1290</td>
			<td>UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G6410B triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G6410B</td>
			<td>MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Zorbax Eclipse Plus C18 column</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Zorbax Eclipse Plus</td>
			<td>colume for UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-methylcytosine</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">SM8900&#160;</td>
			<td>standard 5mC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5-hydroxymethylcytosine (standard)</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">M295900</td>
			<td>standard 5hmC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prdm14 antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS7634</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3a antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS6587</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3b antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13604</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3l antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab3493</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13537</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS1482MH</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6721</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">reverse transcription system</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3500</td>
			<td>RNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A6001</td>
			<td>RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit</td>
			<td style="width:205px;">Cells Biolabs, Inc.</td>
			<td>CBA-302</td>
			<td>&#160;alkaline phosphatase staining analysis</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">mouse ES cells: WT, 129 SvEv</td>
			<td style="width:205px;">Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell strain of mouse ES cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:205px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM510</td>
			<td>cells observation</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">GraphPad Prism 5.0</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad Prism Software Inc.</td>
			<td style="width:119px;">5.0</td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) لديها القدرة على التفريق بين أي من الطبقات الجرثومية الثلاث (الأنسجة أو ميسوديرم أو الأديم الظاهر)، ويمكن أن تولد الكثير من الأنساب للطب التجديدي. وفاق خلية الثقافة في المختبر منذ أمد بعيد موضوع مخاوف على نطاق واسع. تقليديا، يتم الاحتفاظ بالماوس دإط الخلايا في مصل الدم وسرطان الدم من العوامل المثبطة (LIF)-التي تحتوي على المتوسط. بيد تحت ظروف المصل/ليف، الخلايا إظهار عدم التجانس في التشكل والتشكيل الجانبي لتعبير الجينات المتعلقة بلوريبوتينسي، وهي في معظمها في دولة يتواجد. وعلاوة على ذلك، مثقف دإط الخلايا معرض هايبرميثيليشن العالمي، ولكن السذاجة دإط الخلايا من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) والخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) في حالة من هيبوميثيليشن العالمية. الدولة هيبوميثيلاتيد ICM وبجكس يرتبط ارتباطاً وثيقا بما بلوريبوتينسي. لتحسين أساليب الثقافة الخلية الماوس دإط، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة على أساس استخدام مجتمعة بشكل انتقائي من المركبين جزيء صغير للحفاظ على الدولة هيبوميثيلاتيد و pluripotent في الحمض النووي. هنا، نقدم هذا العلاج المشارك من فيتامين ج (Vc)، ويمكن محو PD0325901 حوالي 90 في المائة من 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) في 5 أيام في الماوس دإط الخلايا. المحتوى الذي تم إنشاؤه 5mC يماثل في بجكس. آليا إلى التحقيق يظهر أن PD0325901 أعلى-وينظم التعبير Prdm14 لقمع Dnmt3b (دي نوفو الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي) و Dnmt3l (مساعد Dnmt3b)، بخفض التوليف 5mC دي نوفو . Vc يسهل تحويل 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) تحفزها أساسا Tet1 و Tet2، التي تشير إلى تورط ديميثيليشنز الحمض النووي السلبي والإيجابي على حد سواء. وعلاوة على ذلك، تظهر الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901، مورفولوجيا متجانسة والدولة pluripotent. جماعياً، نقترح الرواية والأسلوب الثقافة الكيميائية-التآزر لتحقيق هيبوميثيليشن الحمض النووي والحفاظ على بلوريبوتينسي في خلايا الفأر ES. طريقة كيميائية تعتمد على جزيء صغير ويتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة المصل، ويحمل وعدا بتوليد خلايا ES متجانسة لمزيد من التطبيقات السريرية، والأبحاث.

Vc/PD0325901 فعل تآزر المحو العالمية للماوس دإط الخلايا. خلايا ES الماوس في مصل الدم يحمل هايبرميثيليشن الحمض النووي، بينما pluripotent الخلايا ICM وبجكس إظهار انتفاء مثلايشن الحمض النووي العالمي والدولة هيبوميثيلاتيد يرتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

باستخدام محلل الجريان خارج الخلية لقياس التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده اثناء الماوس العنبر التقوية

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

نهج شامل لتحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...