Name: an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (21435008 en 21327006 naar H.W.), en de strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB14030200 naar H.W.).

1. voorbereiding
<ol><li>
Bereiden van een oplossing van 1,0 mM PD0325901 (MEK-remmer) en 3.0 mM CHIR99021 (GSK3-remmer).
	<ol>
<li>Weeg 2 mg PD0325901 en voeg 4.15 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.</li>
		<li>Weeg 2 mg CHIR99021 en voeg 1.43 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.</li>
		<li>Volgende reconstitutie, (50 µL/buis in 200 µL PCR buizen) aliquots bij-20 ° C worden opgeslagen en beschermd tegen licht. Verwijder een buis met de bevroren voorraad van een vriezer en ontdooien...

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells.">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo.">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3.">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation.">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li><li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO.">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li><li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals.">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li><li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+modulates+NF&#954;B+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal/stem+cells.">Minocycline modulates NF&#954;B phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos.">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine:+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites.">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li><li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li><li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells.">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li><li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li><li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency.">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li><li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14:+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming.">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+in+the+embryo+and+in+culture.">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li></ol>

In het werk, wij een nieuwe methode van het combineren van Vc en PD0325901 te houden muis ES-cellen om een ongedifferentieerde en hypomethylated state, die werd bereikt door een synergetische actie ter bevordering van DNA demethylatie door Vc en onderdrukken van DOVO DNA aangetoond Methylation door PD0325901. Bovendien toonde muis ES cellen grote morfologie onder het systeem van Vc/PD0325901 cultuur.
Om beter de provincie muis ES-cellen in het Vc/PD0325901 cultuur-systeem, zijn er enk...

ES-cellen zijn afkomstig uit de ICM een blastocyst-1. De cellen kunnen in een Braziliaanse pluripotent zijn en alle somatische lineages en germline cellen2. Oprichting van ES-cellen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van de ontwikkeling processen in vitro en cellen voor medische relevantie voor regeneratieve geneeskunde op basis van hun pluripotent3kan genereren.
Twee groepen seminally de muis ES-cellijnen opgericht in 1981 en wanneer cellen afgeleid van het vroege embryo muis werden gekweekt in de foetale runderserum (FBS)-met medium met muis embryonale fibroblasten (MEFs) als de feeder laag1,4 . MEFs mitotically waren geïnactiveerd en vooraf waren gegroeid in gerechten vóór het kweken van ES-cellen. MEFs ondersteuning voor muis ES cel bijlage en produceren van groeifactoren te bevorderen van voortplanting en onderdrukken de differentiatie5, terwijl FBS essentiële trofische factoren en hormonen voor celproliferatie biedt. Latere studies aangegeven dat LIF geproduceerd door feeder cellen de belangrijkste cytokine voor zelf-vernieuwing en onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen was, en de toevoeging van LIF in het medium voor feeder cellen6 vervangen kon. Het uithoudingsvermogen van muis ES cellen in FBS/LIF medium op feeders is momenteel nog steeds de standaard methode die door veel onderzoekers aangenomen. Echter, sommige problemen met deze benadering van de klassieke cultuur. Ten eerste, feeder cellen afscheiden van overtollige en ongecontroleerde factoren en pathogene besmetting7kunnen veroorzaken. Om te voorkomen dat deze inmenging, coating het oppervlak van gerechten met gelatine en de toevoeging van LIF in serum-bevattende medium zijn alternatieve methoden voor het behoud van de muis ES cellen zonder feeder-laag cellen. Bovendien vertonen de muis ES cellen geteeld onder omstandigheden van de serum/LIF morfologische heterogeniteit in cel populaties, en zelfs in de mate van expressie van pluripotent-gerelateerde factoren8. Recente studies suggereren dat onder omstandigheden van de serum/LIF, de kern pluripotent-gerelateerde transcriptiefactoren (met inbegrip van SOX2, Nanog en OCT4) de pluripotent door middel van LIF en WNT signalering ondersteunen kunnen; echter, met name, zij ook activeren een fibroblast groeifactor (FGF) signaal om differentiatie8trigger. Als gevolg van de ambivalente dubbele actie van de kern transcriptiefactoren, muis ES cellen gekweekt in het serum aanwezig heterogeniteit, bestaande uit twee verwisselbare populaties, een soortgelijk aan ICM en een ander lijkt de op de voorbehandelde epiblast staat8. Bovendien, muis ES cellen in serum vertonen vaak global hypermethylation9, overwegende dat ICM en PGCs zijn in een staat van de wereldwijde hypomethylated, die nauw is met hun pluripotent9,10 verbonden.
Er is een aanzienlijke vraag naar het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het kweken van muis ES-cellen. Diverse verbeterde protocollen zijn vastgesteld sinds 200311 maar er nog steeds enkele beperkingen en tekortkomingen7. Sinds 2008, het gecombineerde gebruik van twee kleine-molecuul kinase-remmers, PD0325901 (de Inhibitor van de omwenteling van de mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) / extracellulaire-signaal-gereglementeerde kinase (ERK) (MEK)) en CHIR99021 (de Inhibitor van de omwenteling van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3)), in N2B27 medium met LIF en zonder serum voor kweken muis ES12 cellennieuwe perspectieven heeft geopend. Deze nieuwe beschreven medium wordt gekenmerkt door het gebruik van twee remmers (2i). Muis ES-cellen gekweekt in 2i/LIF medium zijn meer homogeen in cel populaties en de uitdrukking van pluripotent factoren. Daarnaast vertonen 2i/LIF-gekweekte muis ES-cellen DNA hypomethylation wereldwijd, die dichter bij ICM-achtige cellen9,13is. Zelfs zo, heeft 2i cultuur zijn nadelen. PD0325901 en CHIR99021 zijn onoplosbaar in water en in het algemeen worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)-op basis van de stamoplossing te voegen in een kweekvloeistof. Studies hebben aangetoond dat langdurig en lage dosis blootstelling van cellen aan DMSO kan leiden tot cytotoxiciteit14.
Hier, we twee kleine-molecuul verbindingen gebruikt en ontwikkelde een nieuwe methode van de cultuur van muis ES-cellen. De nieuwe cultuur methode combineert Vc en MEK-remmer PD0325901 ter bevordering van DNA hypomethylation snel en doeltreffend tot een vergelijkbaar niveau van PGC, genoemd als het protocol voor het kweken van Vc/PD0325901. Muis ES cellen in serum-bevattende medium Vc/PD0325901-toegevoegde vertonen homogeniteit in de morfologie en zijn opgelopen in een grondtoestand. Vergeleken met 2i cultuur, muis ES cellen gekweekt onder Vc/PD0325901 voorwaarden vertonen sneller kinetiek van DNA-demethylatie en het hypomethylation niveau vergelijkbaar met die van PGC kunnen bereiken. Bovendien, het gebruik van een enkele inhibitor (PD0325901) vermindert de input DMSO tot medium in vergelijking met die gebruikt in 2i (PD0325901/CHIR99021) en vermindert de schade aan cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum Australia source</td>
			<td style="width:205px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">35-076-CV</td>
			<td style="width:251px;">Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high glucose</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30022</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5493</td>
			<td>Cells rinse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypsin</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30042</td>
			<td>Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gelatin</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">48722</td>
			<td>Dishes coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">vitamin C</td>
			<td style="width:205px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">XW00508171</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Bioscience water purification systemr</td>
			<td style="width:205px;">Purelab</td>
			<td style="width:119px;">Ultra</td>
			<td>Ultra water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Cell freezing medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuger</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5427R</td>
			<td>DNA and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">43815</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td>Genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Determination of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf intestinal phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0290</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0303</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">snake venom phosphodiesterase I</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4506</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanosep 3K Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td style="width:119px;">OD003C35</td>
			<td>filtration of digested DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1290 UHPLC system</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1290</td>
			<td>UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G6410B triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G6410B</td>
			<td>MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Zorbax Eclipse Plus C18 column</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Zorbax Eclipse Plus</td>
			<td>colume for UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-methylcytosine</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">SM8900&#160;</td>
			<td>standard 5mC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5-hydroxymethylcytosine (standard)</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">M295900</td>
			<td>standard 5hmC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prdm14 antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS7634</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3a antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS6587</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3b antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13604</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3l antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab3493</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13537</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS1482MH</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6721</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">reverse transcription system</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3500</td>
			<td>RNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A6001</td>
			<td>RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit</td>
			<td style="width:205px;">Cells Biolabs, Inc.</td>
			<td>CBA-302</td>
			<td>&#160;alkaline phosphatase staining analysis</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">mouse ES cells: WT, 129 SvEv</td>
			<td style="width:205px;">Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell strain of mouse ES cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:205px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM510</td>
			<td>cells observation</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">GraphPad Prism 5.0</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad Prism Software Inc.</td>
			<td style="width:119px;">5.0</td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c

Embryonale stamcellen (ES) hebben het potentieel om te onderscheiden in een van de drie lagen van de kiem (endoderm, mesoderm of ectoderm), en vele geslachten voor regeneratieve geneeskunde kunnen genereren. ES cel cultuur in vitro lang het onderwerp geweest van wijdverbreide bezorgdheid. Klassiek, muis ES-cellen worden bijgehouden in serum en leukemie remmende factor (LIF)-met medium. Echter onder voorwaarden van de serum/LIF, cellen heterogeniteit in de morfologie en het profiel van de expressie van genen pluripotent-gerelateerde weergeven, en zijn meestal in een metastabiele staat. Bovendien, gekweekte ES-cellen vertonen wereldwijde hypermethylation, maar naïef ES-cellen van de binnenste cel massa (ICM) en primordial kiemcellen (PGCs) zijn in een staat van wereldwijde hypomethylation. De toestand van de hypomethylated van ICM en PGCs is nauw verbonden met hun pluripotent. Ter verbetering van muis ES cel cultuur methoden, hebben we onlangs een nieuwe methode gebaseerd op het selectief gecombineerd gebruik van twee kleine-molecuul verbindingen de DNA-hypomethylated en pluripotente toestand te handhaven ontwikkeld. Hier presenteren we dat de gezamenlijke behandeling van vitamine C (Vc) en PD0325901 kunt ongeveer 90% van de 5-methylcytosine (5mC) 5 dagen op muis ES cellen wissen. De inhoud van de gegenereerde 5mC is vergelijkbaar met die in PGCs. Het mechanistisch onderzoek blijkt dat PD0325901 up-regelt Prdm14 expressie om te onderdrukken Dnmt3b (DOVO DNA methyltransferase) en Dnmt3l (de cofactor van Dnmt3b), door vermindering van DOVO 5mC synthese. VC vergemakkelijkt de omzetting van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) gekatalyseerde voornamelijk door Tet1 en Tet2, met vermelding van de betrokkenheid van zowel de actieve als de passieve DNA-demethylations. Bovendien Toon muis ES cellen onder Vc/PD0325901 voorwaarden, homogene morfologie en pluripotente staat. Gezamenlijk stellen wij een roman en chemische-synergy cultuur methode voor het bereiken van DNA-hypomethylation en het onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen. De kleine-molecuul chemische-afhankelijke methode overwint de grote tekortkomingen van serum cultuur en houdt belofte voor het genereren van homogene ES-cellen voor verdere klinische toepassingen en onderzoeken.

VC/PD0325901 geïnduceerde synergetisch global wissing van muis ES-cellen. Muis ES cellen in serum vertonen DNA hypermethylation, terwijl pluripotente ICM cellen en PGCs Toon globale verwijdering van methylation van DNA en de hypomethylated staat nauw verbonden met hun pluripotent9,10 is.
Eerder, wij en anderen gevonden dat Vc Tet-gemedieerde 5mC demethylatie<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Verbeterde UPLC-UV-methode voor de kwantificering van vitamine C in sla variëteiten(Lactuca sativa L.) en Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Een alomvattende benadering om de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels te analyseren

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...