Name: an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

이 작품은 국가 자연 과학 재단의 중국 (21435008 및 호우를 21327006), 그리고 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 (호우에 XDB14030200).

1입니다. 준비
<ol><li>
1.0 m m PD0325901의 솔루션 (MEK 억제제)와 3.0 m m CHIR99021 준비 (GSK3 억제제).
	<ol>
<li>PD0325901의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 4.15 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>CHIR99021의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 1.43 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>다음 재구성,-20 ° C에서 aliquots (200 µ L PCR 튜브에 50 µ L/튜브)를 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 냉장고?...

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells.">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo.">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3.">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation.">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li><li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO.">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li><li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals.">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li><li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+modulates+NF&#954;B+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal/stem+cells.">Minocycline modulates NF&#954;B phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos.">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine:+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites.">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li><li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li><li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells.">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li><li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li><li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency.">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li><li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14:+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming.">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+in+the+embryo+and+in+culture.">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li></ol>

작품, 우리 시연 Vc 및 PD0325901 vc DNA demethylation를 홍보 하 고 de novo DNA 억제 시너지 행동에 의해 달성 되었다는 undifferentiated 및 hypomethylated 상태에서 마우스 ES 세포를 유지 하기 위해 결합 하는 새로운 방법 메 틸 PD0325901입니다. 또한, 마우스 ES 세포 Vc/PD0325901 문화 시스템 아래 큰 형태를 보였다.
더 나은 마우스 ES 세포의 상태는 Vc/PD0325901 문화 시스템에서을 하려면 몇 가지...

ES 세포 blastocyst1의 ICM에서 기인 된다. 셀은 pluripotency 상태에 있고 모든 계보 체세포와 생식 세포2형성할 수 있다. ES 세포의 설립 기회 개발 조사를 생체 외에서 처리 하 고 그들의 pluripotency3에 기반 하는 재생 의학에 대 한 의료 관련의 세포를 생성할 수 있습니다 제공 합니다.
두 그룹은 seminally 1981 년에 마우스 ES 세포 라인을 설립 하 고 소 태아 혈 청 (FBS)에 셀 초기 마우스 배아에서 파생 했다 경작 하는 때-급지대 레이어1,4로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)와 매체를 포함 하 . MEFs mitotically 비활성화 했다 고 미리 이전에 ES 세포를 배양 접시에 성장 했다. MEFs는 마우스 ES 셀 첨부 파일에 대 한 지원을 제공 하 고 전파를 홍보 하 여 필수적인 영양 요소와 세포 증식에 대 한 호르몬을 제공 하는 FBS 차별화5억 누르다 성장 인자를 생산. 후속 연구 LIF 피더 세포에 의해 생성 했다 자기 갱신 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수에 대 한 주요 cytokine 매체에 LIF의 추가 피더 세포6에 대 한 대체할 수 있는 표시. 현재, 지류에 FBS/LIF 매체에 마우스 ES 세포의 주 아직도 많은 연구자에 의해 채택 된 표준 방법입니다. 그러나,이 고아 한 문화 접근 몇 가지 문제가 발생합니다. 첫째, 피더 세포 분 비 과잉 통제 요인 및 병원 성 오염7을 발생할 수 있습니다. 혈 청에 포함 된 젤라틴과 요리 표면 및 LIF의 추가 코팅이 간섭을 유발 하지 않도록 매체 급지대 계층 셀 없이 마우스 ES 세포를 유지 하기 위한 대체 방법이 있습니다. 또한, 혈 청/LIF 조건 하에서 성장 하는 마우스 ES 세포 형태학이 세포 인구 및 pluripotency 관련 요인8식 수준 에서도 전시. 최근 연구 제안 조건 하에서 혈 청/LIF, (를 포함 하 여, Nanog, OCT4, SOX2) pluripotency 관련 핵심 전사 인자 LIF 및 WNT 신호; 통해 pluripotency 유지할 수 있습니다. 그러나, 특히, 그들은 또한 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 신호 차별화8트리거를 활성화 합니다. 핵 녹음 방송 요인의 상반 된 이중 작용으로 인해 마우스 ES 세포 혈 청에서 교양된 ICM을 닮은 끝났다 epiblast 상태8다른 유사한 두 개의 상호 인구의 구성 된이 현재. 또한, 마우스 ES 세포 혈 청에 자주 전시 글로벌 hypermethylation9, ICM과 PGCs 그들의 pluripotency9,10와 밀접 하 게 연결 되는 글로벌 hypomethylated 상태에 있는 반면.
마우스 ES 세포 배양을 위한 새로운 방법을 개발 하는 상당한 수요가 있다. 여러 가지 향상 된 프로토콜 200311 이후 설립 되었습니다 하지만 몇 가지 제한 사항 및 단점7계속. 2008 년 이후, 두 개의 작은 분자 kinase 억제제, PD0325901의 결합된 이용 (물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)의 억제 물 extracellular 신호 통제 / 키 니 아 제 (ERK) (MEK)) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase의 억제제를 키 니 아 제 3 (GSK3)), 자란 마우스 ES 세포12대 한 N2B27 에 매체 LIF와 혈 청 하지 않고 새로운 관점 오픈 했습니다. 이 새로운 정의 된 매체 2 억제제 (2i)의 사용에 의해 특징입니다. 2i/LIF 매체에 경작 마우스 ES 세포는 세포 인구 및 pluripotency 요인의 표현에 더 균질. 또한, 2i/LIF 교양 마우스 ES 세포 전시 DNA hypomethylation 세계적으로 ICM 같은 셀9,13에 가깝다. 그럼에도 불구 하 고, 2i 문화는 그것의 단점이 있습니다. PD0325901 및 CHIR99021는 물에 용 해 일반적으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 해산-문화 매체에 그들을 추가 하려면 재고 솔루션을 기반으로. 연구는 그 장기 그리고 DMSO에 셀의 낮은 복용량 노출 세포 독성14이어질 수 있습니다.
우리 두 작은 분자 화합물을 활용 하는 여기, 마우스 ES 세포의 새로운 문화 방법을 개발 하 고. 새로운 문화 메서드 빠르게 DNA hypomethylation 홍보 Vc와 MEK 억제제 PD0325901를 결합 하 고 효과적으로 PGC의 유사한 수준에 임명 된 Vc/PD0325901 자란 프로토콜. Vc/PD0325901 추가 혈 청에 포함 된 매체에 마우스 ES 세포 형태학에 동질성을 전시 하 고 접지 상태에서 지속. 2i 문화에 비해, Vc/PD0325901 조건 하에서 경작 하는 마우스 ES 세포 DNA demethylation의 빠른 활동을 전시 하 고 PGC의 비교 hypomethylation 수준에 도달할 수 있습니다. 또한, 단일 억제제 (PD0325901)를 사용 하 여 2에서 사용에 비해 중간에 DMSO의 입력된 금액 감소 (PD0325901/CHIR99021) 셀에 피해를 감소 시킨다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum Australia source</td>
			<td style="width:205px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">35-076-CV</td>
			<td style="width:251px;">Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high glucose</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30022</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:205px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Component of mouse ES cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5493</td>
			<td>Cells rinse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypsin</td>
			<td style="width:205px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30042</td>
			<td>Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gelatin</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">48722</td>
			<td>Dishes coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">vitamin C</td>
			<td style="width:205px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">XW00508171</td>
			<td>small-molecule chemical for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Bioscience water purification systemr</td>
			<td style="width:205px;">Purelab</td>
			<td style="width:119px;">Ultra</td>
			<td>Ultra water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Cell freezing medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuger</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5427R</td>
			<td>DNA and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">43815</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td>Component of RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td>Genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:205px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Determination of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf intestinal phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0290</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0303</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">snake venom phosphodiesterase I</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4506</td>
			<td>DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanosep 3K Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td style="width:119px;">OD003C35</td>
			<td>filtration of digested DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1290 UHPLC system</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1290</td>
			<td>UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G6410B triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G6410B</td>
			<td>MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Zorbax Eclipse Plus C18 column</td>
			<td style="width:205px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Zorbax Eclipse Plus</td>
			<td>colume for UHPLC separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-methylcytosine</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">SM8900&#160;</td>
			<td>standard 5mC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5-hydroxymethylcytosine (standard)</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">M295900</td>
			<td>standard 5hmC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prdm14 antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS7634</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3a antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS6587</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3b antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13604</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt3l antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab3493</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnmt1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab13537</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>BS1482MH</td>
			<td>Western blot analysis-primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6721</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td>Western blot analysis-secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">reverse transcription system</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3500</td>
			<td>RNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A6001</td>
			<td>RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit</td>
			<td style="width:205px;">Cells Biolabs, Inc.</td>
			<td>CBA-302</td>
			<td>&#160;alkaline phosphatase staining analysis</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">mouse ES cells: WT, 129 SvEv</td>
			<td style="width:205px;">Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell strain of mouse ES cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:205px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM510</td>
			<td>cells observation</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">GraphPad Prism 5.0</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad Prism Software Inc.</td>
			<td style="width:119px;">5.0</td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c

배아 줄기 (ES) 세포 (endoderm, mesoderm, 또는 ectoderm), 3 개의 세균 층의 구분을 하 고 재생 의학에 대 한 많은 계보를 생성할 수 있습니다. ES 세포 문화에서 체 외에 는 오랫동안 광범위 한 관심사의 주제. 마우스 ES 세포 혈 청 및 백혈병 금지 요인 (LIF)에서 유지 관리 하는 고전적인,-포함 하는 매체. 그러나, 혈 청/LIF 조건 하에서 세포 형태학 및 pluripotency 관련 유전자의 식 프로 파일에서이 표시 하 고 준 상태에서 주로. 또한, 교양된 ES 세포 전시 글로벌 hypermethylation 하지만 순진한 ES 세포는 안 세포 질량 (ICM) 및 원시 생식 세포 (PGCs)의 글로벌 hypomethylation의 상태에 있습니다. ICM과 PGCs의 hypomethylated 상태 그들의 pluripotency와 밀접 하 게 연결 됩니다. 마우스 ES 세포 문화 방법 개선, 최근 DNA hypomethylated 만능 상태를 유지 하기 위해 두 개의 작은 분자 화합물의 선택적으로 결합 된 사용률을 기반 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 여기, 우리는 비타민 C (Vc)의 공동 치료를 제시 하 고 PD0325901 마우스 ES 세포에서 5 일에 5-methylcytosine (5mC)의 약 90%를 지울 수 있습니다. 생성 된 5mC 콘텐츠는 PGCs에 비교. 기계 조사 보여준다는 PD0325901 최대-조절 억제 Dnmt3b Prdm14 식 (de novo DNA methyltransferase) 및 Dnmt3l (Dnmt3b의 공동 인자), 드 노 보 5mC 합성을 감소 시켜. Vc는 모두 수동 및 활성 DNA demethylations의 참여를 나타내는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) Tet1 및 Tet2에 의해 주로 촉매 변환 용이. 또한, Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 균질 형태학 및 만능 상태를 표시합니다. 샨 다, 우리 소설과 화학 시너지 문화 DNA hypomethylation 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수를 달성 하기 위한 방법을 제안 합니다. 작은 분자 화학 종속 메서드 혈 청 문화, 그리고 균질 ES 세포 연구에 대 한 추가 임상 응용 프로그램 생성을 보유 약속의 주요 단점을 극복 했다.

Vc/PD0325901 synergistically 마우스 ES 세포의 글로벌 삭제를 유도 한다. 혈 청에 마우스 ES 세포 pluripotent ICM 세포와 PGCs DNA 메 틸 화의 글로벌 삭제 표시 하 고 hypomethylated 상태가 그들의 pluripotency9,10에 밀접 하 게 연관 DNA hypermethylation 전시.
이전에 우리와 다른 Vc Tet 중재 5mC demethylation<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C at JoVE.com

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

연구

생화학

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

양상추 품종(Lactuca sativa L.) 및 작물 야생 친척(Lactuca spp.) 비타민 C의 정량화를위한 향상 UPLC-UV 방법

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

그람 양성 박테리아 성장의 소분자 억제제 인 Masarimycin의 합성

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

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미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

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A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

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뇌혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 포괄적인 접근법

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...