Name: assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R35 GM118177 til PND.

1. forberedelse av løsninger <ol><li>forberede HL-5 media bruker følgende: 10 g/L Dekstrose, 10 g/L proteose pepton 5 finans gjærekstrakt, 0.965 finans Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 finans KH 2 PO 4, og med mindre annet er angitt, 0,03 finans streptomycin i deionisert vann. Autoclave medium og store ved romtemperatur. 
	Merk: På grunn av forskjellene mellom proteose pepton og gjær ekstrakt fra forskjellige leverandører og mellom individuelle kladder, pH av...

<ol>
	<li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+chemotaxis:+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility,+directional+sensing,+and+polarity.">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells.">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis.">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients.">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li><li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt/PKB+during+aggregation.">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li><li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell's+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis.">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li><li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3,4,5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis.">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li><li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration.">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li><li>Nishikawa, M., H&#246;rning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis.">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li><li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization.">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li><li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system.">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves,+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization.">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li><li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility.">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).</li><li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration.">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li><li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+towards+a+paradigm:+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes.">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li><li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation.">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li><li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling.">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li><li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li><li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate.">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li><li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks.">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li><li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants.">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li><li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA.">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemotaxis+in+Dictyostelium.">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum.">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2/3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells.">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li><li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells.">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li><li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Akt/PKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium.">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li><li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations.">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li></ol>

Metodene som er beskrevet her tilbyr en praktisk måte å vurdere både befolkning og enkeltcelle virkemåten svar hvis du vil skråstille flyt. Viktigere, mens tidligere studier analysert lokalisering av fører og henger kanten markører under overføringen, kan nåværende tilnærming etterforskning til umiddelbare virkninger ved å bruke skjær flyten akutt. Benytter denne metoden viste vi at, faktisk, første reaksjon av celler for å skråstille flyt ikke krever celle migrasjon. I stedet, rask og forbigående svaret...

Migrering av eukaryote celler er partisk av ulike kjemiske og fysiske signaler i miljøet, inkludert graderinger av løselig eller substrat bundet chemoattractants, variabel stivhet av underlag, elektrisk felt eller skjær flyt. Selv om det har vært mange fremskritt i vår forståelse av molekylære mekanismer kjøring chemotaxis, mindre er kjent om andre typer regissert migrasjon og hvordan disse ulike signaler er integrert på cellenivå å produsere en enhetlig trekkfugler svar.
Regisserte migrering mot en økende konsentrasjon av en chemoattractant innebærer tre atferdsmessige komponenter: motilitet, retningsbestemt sensing og polaritet1. Motilitet refererer til tilfeldige movement celler ved pseudopod protrusion. Retningsbestemt sensing er muligheten for en celle for å finne kilden til en chemoattractant, noe som kan skje selv i immobilisert celler. Polaritet refererer til mer stabil asymmetrisk fordeling av intracellular komponenter mellom ledende og henger kanten av en celle, som fører til økt utholdenhet i bevegelse.
Cellulær respons til en chemoattractant, avhengig av aktiviteten til fire konseptuelt definerte regulatoriske nettverk: reseptor / G protein, signaltransduksjon, begrepsordbok cytoskjelett og polaritet1. Chemoattractant binding til G protein-kombinert reseptoren overfører signalet via heterotrimeric G proteiner α og βγ til nedstrøms signal signaltransduksjon nettverket som forsterker retningsbestemt signalet. Flere veier i signal signaltransduksjon nettverket fungerer parallelt og mate inn utgangen cytoskjelett nettverket bias begrepsordbok polymerisasjon og påfølgende pseudopod protrusion, i retning av graderingen. Blant viktige regulatorer av chemotaxis er Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), fosfatase og tensin homolog (PTEN) og guanylyl cyclase. Tilbakemelding mekanismer i signal signaltransduksjon nettverket og mellom signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk ytterligere forsterke svaret. Endelig, dårlig definerte polaritet nettverket mottar inndata fra utgangen cytoskjelett, og ytterligere skjevheter signal signaltransduksjon nettverket for å fremme vedvarende migrasjon i retning av graderingen.
Mye av vår mekanistisk forståelse av chemotaxis ble gjort mulig på grunn av utviklingen av fluorescently-merket biosensors for ulike komponenter av regulatoriske nettverk. Mange chemotaxis regulatorer har en asymmetrisk fordeling på regulatoriske molekylet seg selv eller sin virksomhet. For eksempel biosensors som gjenkjenner aktivert versjoner av små GTPases Ras og Rap1-Ras-bindende domener av Raf1 (referert til som RBD her) og RalGDS, henholdsvis-lokalisere til forkanten av en chemotaxing celle2,3. Tilsvarende PI3K og dens fabrikat phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), gjenkjennes av et pleckstrin homologi (PH) domene, viser lokalisering på forsiden av en celle4,5. I kontrast, en 3-fosfatase PTEN, konverterer som PIP3 tilbake til phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, regionaliserer henger kanten av cellen6. Viktigere, endre disse biosensors deres lokalisering svar på globale stimulering med en chemoattractant. Ledende markører, som er cytosolic eller på tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, relocalize til cortex, mens henger kanten markører, som har kortikale lokalisering og er fraværende fra tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, blir cytosolic etter stimulering. Analyse av biosensor distribusjon svar på globale stimulering med en chemoattractant minimerer bidrag av motilitet og polaritet, som ofte forvirrer observasjoner. Global eller uniform stimulering av en celle hjuloppheng med en chemoattractant brukes også som et verktøy til å vurdere endringer for hele befolkningen i protein aktivisering, ofte oppdages av protein fosforylering7,8,9 . Denne biokjemiske analysen brukes hovedsakelig å få timelige informasjon, mens mikroskopi brukes til å samle både timelig og romlig informasjon om virkemåten av ulike komponenter av regulatoriske nettverk.
Signalet signaltransduksjon nettverket har funksjoner av en nervøs systemet10,11. Svar på supra-terskel chemotactic stimuli er "all-or-none" og vise ildfaste periodene. Svar også utløses stochastically og kan vise oscillasjon atferd. Signalet signaltransduksjon hendelser er lokalisert i områder på cortex som overføres som bølger12,13,14,15. Foran, tilbake, markører er rekruttert til eller dissociate fra, de aktive sonene av overfører bølger. På grunn av ildfaste regionen etterfølgende aktive sonen, tilintetgjøre oppositely rettet bølgene som de møter. Overfører signalet signaltransduksjon bølgene ligger de mobilnettet utstikkende deler som megle celle migrasjon10.
Mye av den nevnte informasjonen om chemotaxis kom fra studiene på den sosiale amoeba Dictyostelium discoideum, selv om lignende regulatoriske mekanismer er også nøytrofile og andre pattedyr cellen typer16 . Dictyostelium er en veletablert modell organisme har en robust chemotactic reaksjon under sult, når tusenvis av enkeltceller migrere mot en aggregering senter, til slutt danne en flercellet frukt kroppen inneholder sporer. Chemotaxis er også avgjørende under én celle vekst stadium i denne organismen for å finne bakteriell mat kilder. Viktigere, er migrering av Dictyostelium enkeltceller bemerkelsesverdig lik migrering av pattedyr nøytrofile eller metastatisk kreftceller, som gjennomgå meget rask amoeboid-type overføring. Faktisk, er både generelle topologien regulatoriske nettverk, samt mange av de individuelle signaltransduksjon trasé involvert i chemotaxis bevart mellom Dictyostelium og leukocytter hos pattedyr17. Videre bruke andre celler, for eksempel fibroblaster, receptor tyrosine kinaser (RTK) i stedet for GPCRs; men kan RTKs mate inn lignende nettverk.
I motsetning til chemotaxis mangler grundig forståelse av signalnettverk mekanismer som driver ulike transportmåter regissert migrasjon. Tilsvarende cellene migrerer en chemoattractant stigning flere studier har rapportert utløsning eller lokalisering av typiske ledende markører, inkludert begrepsordbok polymerisasjon, PIP3 og/eller ekstracellulær signal regulert kinase (ERK) 1/2, på den fronten celleområde gjennomgår regisserte migrering Svar å skråstille flyt eller endringer i elektrisk felt18,19,20,21. Men i disse studiene resulterte kontinuerlig eksponering til stimulans også i celle migrasjon, forlate åpne spørsmålet om, for eksempel den ledende markører lokalisere spesielt som svar på en stimulans, eller om de bare lokalisere i forkant på grunn av økt antall eukaryotene på forsiden av en overføring celle.
Vi utviklet analyser som tillater oss å observere svaret celleområde akutt mekanisk forstyrrelsene levert som skjær flyt både på befolkningsnivå og individuelle celler22. Ligner på globale stimulering med en chemoattractant, akutt stimulerendesjon med skjær flyt kan studere en cellulær respons til en mekanisk stimulans uten forvirrende bidrag fra motilitet eller polaritet. Kombinere disse biokjemiske og mikroskopiske analyser med genetisk eller farmakologiske forstyrrelser tillater oss å lære om hvordan mekanisk stimuli oppfattes og overføres. Videre, denne tilnærmingen gir også en ny metode for å trykke inn systemet nedstrøms chemoattractant reseptoren i fravær av en chemoattractant, og dermed isolere signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverkene fra reseptor/G protein nettverk.
Bruke teknikkene nedenfor vi nylig vist at akutt skjæring stress fører til aktivering av flere komponenter i chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk22. Ved å bruke akutt mekanisk stimulans på ulike intervaller, viste vi at tilsvarende til chemoattractants, respons på mekanisk stimuli også viser funksjonene i en nervøs systemet, inkludert all-or-none virkemåten til svaret under Mette forhold og tilstedeværelse av en ildfast periode. Til slutt, ved å kombinere mekanisk og kjemisk stimulering vi viste at to stimuli dele signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk, som sannsynligvis gir mulighet for integrering av flere stimuli til bias celle migrasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0120-17-6</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-445</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P386-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10040525</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Bacto)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-100</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O1728-500</td>
			<td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-680-1100MG</td>
			<td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610610</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610404</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-994-911</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S390-500</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450029</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2060</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-100UL</td>
			<td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>PI46430</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20278</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td>
			<td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene cup (5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13915-985</td>
			<td>Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide with a channel (&#956;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80316</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10978</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&#215;/1.25&#8211;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>DM 16000</td>
			<td>An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021D and 5192000027</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (Femtotip; 1 &#956;m outside diameter, 0.5 &#956;m inside diameter )</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-472</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-338</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software (Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td>
			<td>Gradientech</td>
			<td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td>
			<td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

Chemotaxis eller migrering opp gradering av en chemoattractant, er det beste forståtte modusen rettet migrasjon. Studier med sosiale amoeba Dictyostelium discoideum avslørte at et komplekst signal signaltransduksjon nettverk av parallelle forsterker responsen på chemoattractants, og fører til partisk begrepsordbok polymerisasjon og protrusion av en pseudopod i den retning på en forløpning. Derimot er molekylære mekanismer kjører andre typer regissert migrasjon, for eksempel på grunn av eksponering for skråstille flyt eller elektrisk felt, ikke kjent. Mange regulatorer av chemotaxis utstillingen lokalisering ledende eller henger kanten av en overføring celle, samt vise forbigående endringer i lokalisering eller etter globale stimulering med en chemoattractant. For å forstå molekylære mekanismer av andre typer regissert migrasjon utviklet vi en metode som tillater undersøkelse av cellulær respons til akutt mekanisk stimulering basert på kort (2-5 s) eksponering å skråstille flyt. Denne Stimuleringen kan leveres i en kanal mens imaging celler som uttrykker fluorescently-merket biosensors for å undersøke enkeltcelle atferd. I tillegg stimuleret celle befolkningen plate, lysed, og immunoblotted ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner aktive versjoner av proteiner av interesse. Ved å kombinere begge analyser, kan en undersøke en rekke molekyler aktivert av endringer i subcellular lokalisering og/eller fosforylering. Benytter denne metoden vi funnet ut at akutt mekanisk stimulering avtrekker aktivisering av chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk. Muligheten til å undersøke mobilnettet svar til akutt mekanisk stimulering er viktig for å forstå initiering hendelsene nødvendig for skjær flyt-indusert motilitet. Denne tilnærmingen har også et verktøy for å studere chemotactic signal signaltransduksjon nettverket uten forvirrende påvirkning av chemoattractant reseptoren.

Timelige svar av chemotaxis regulatorer akutt mekanisk stimulering
For å vurdere svaret D. discoideum celler til mekanisk stimulering, ble tilhenger aggregering kompetente celler utsatt for en kort puls av skjær. Aggregering-kompetent D. discoideum celler skiller leiren, som kan være kjente av omkringliggende celler. For å overvinne bidrag av celle-celle signalisering, ble celler behandlet med koffein, som hem...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Vurdering av Dictyostelium discoideum svaret til akutt mekanisk stimulering

Her beskriver vi metoder for å vurdere cellulær respons til akutt mekanisk stimulering. I mikroskopi-baserte analysen undersøker vi lokalisering av fluorescently-merket biosensors etter kort stimulering med skjær flyt. Vi tester også av interesse i svaret til akutt mekanisk stimulering biokjemisk.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Mekanisk stimulering av chondrocyttransplantasjon-agarose Hydrogeler

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Gransker Funksjon Coronin A i tidlig sult svar av<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Av Aggregering Analyser

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...