Name: assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант R35 GM118177 НПР.

1. Подготовка решения <ol><li>подготовку гл-5 средства массовой информации, используя следующее: глюкоза 10 г/Л, 10 г/Л proteose Пептон, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 0.965 г/Л Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 г/Л х 2 PO 4 и, если не указано иное, стрептомицина 0,03 г/Л в деионизированной воде. Автокла...

<ol>
	<li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+chemotaxis:+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility,+directional+sensing,+and+polarity.">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells.">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis.">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients.">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li><li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt/PKB+during+aggregation.">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li><li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell's+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis.">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li><li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3,4,5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis.">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li><li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration.">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li><li>Nishikawa, M., H&#246;rning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis.">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li><li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization.">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li><li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system.">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves,+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization.">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li><li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility.">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).</li><li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration.">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li><li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+towards+a+paradigm:+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes.">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li><li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation.">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li><li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling.">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li><li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li><li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate.">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li><li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks.">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li><li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants.">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li><li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA.">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemotaxis+in+Dictyostelium.">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum.">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2/3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells.">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li><li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells.">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li><li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Akt/PKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium.">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li><li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations.">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li></ol>

Методы, описанные здесь предлагают удобный способ оценить как населения, так и поведение отдельных клеток в ответ для наклона потока. Важно отметить, что в то время как предыдущие исследования анализируются локализации ведущих и отставание края маркеры во время миграции, нынешний подх...

Миграции эукариотических клеток является предвзятым, различные химические и физические сигналы в окружающей среде, включая градиенты растворимые или привязанных к подложке chemoattractants, переменной жесткости субстратов, электрические поля, или сдвига потока. Несмотря на многие достижения в наше понимание молекулярных механизмов вождения хемотаксис, меньше известно о других типах режиссер миграции и интеграции этих разнообразных сигналов на клеточном уровне для получения единой мигрирующих ответ.
Режиссер, миграция к растущей концентрации хемотаксического включает три поведенческих компонентов: подвижность, направленного зондирования и полярность1. Подвижность относится к случайное движение клеток достигается pseudopod выступа. Направленного зондирования является способность обнаружить источник хемотаксического ячейки, который может произойти даже в прикол клетки. Полярности относится к более стабильной асимметричные распределения внутриклеточных компонентов между ведущие и отстающие края клетки, что приводит к увеличению сохраняемости в движении.
Клеточный ответ хемотаксического зависит деятельность четырех концептуально определены нормативные сетей: рецептор / белок G, сигнальной трансдукции, Цитоскелет актина и полярность1. Хемотаксического связывание с рецепторами сочетании белок G передаёт сигнал через гетеротримерные G белки α и βγ к течению сигнала трансдукции сеть, которая усиливает сигнал направленности. Несколько путей в рамках сети трансдукции сигнала действовать параллельно и кормить в сеть Цитоскелет актина смещения актина полимеризации, и последующего pseudopod выступа, в направлении градиента. Среди важных регуляторов хемотаксис являются Ras ГТФазы, TorC2, phosphoinositide 3-киназы (PI3K), фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN) и что циклазы. Механизмы обратной связи в рамках сети трансдукции сигнала и между сигнала и Цитоскелет актина сетей далее усиливать ответа. Наконец плохо определенной полярности сети получает входные данные из цитоскелет актина и далее отклонений сети трансдукции сигнала для содействия постоянные миграции в направлении градиента.
Большая часть наших механистического понимания хемотаксис стало возможным из-за развития биодатчики дневно тегами для различных компонентов систем регулирования. Многие хемотаксис регуляторы имеют асимметричные распределения, либо самой молекулы регулирования или его деятельности. Например биосенсоры, которые признают активации версии небольших ран GTPases и Rap1 – рас связывания доменов Raf1 (именуемый RBD здесь) и RalGDS, соответственно — локализации до переднего края ячейки2,chemotaxing3. Аналогично, PI3K и ее продукта фосфатидилинозитол (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), признанные pleckstrin гомологии (PH) домена, также показывают локализации в передней части клетки4,5. В отличие от 3-фосфатазы PTEN, который преобразует PIP3 обратно в фосфатидилинозитол (4,5)-Бисфосфат, локализует отстающие края ячейки6. Важно отметить, что эти биодатчики изменить их локализация в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического. Передний край маркеры, которые цитозольной или на советы выступы в ячейке отдых, relocalize кору, тогда как отставание края маркеров, которые корковых локализации и отсутствуют от кончиков выступы в ячейке отдых, стать цитозольной после стимуляция. Анализ распределения биосенсор в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического минимизирует вклад моторики и полярность, которые часто посрамить замечания. Глобальные или единообразных стимуляции суспензию клеток с хемотаксического также используется как инструмент для оценки всего населения изменения в активации белка, часто определяется белка фосфорилирование7,8,9 . Этот assay биохимических используется главным образом для получения временной информации, тогда как микроскопии используется для сбора во временной и пространственной информации о поведении различных компонентов систем регулирования.
В сети трансдукции сигнала включает в себя черты возбудимых системы10,11. Ответы на выше порогового уровня эозинофилов стимулы «логики» и отображать огнеупорных периодов. Ответы также активируются ковшах и может показать колебательной поведение. События трансдукции сигнала локализованы в регионы коры, которые распространяются как волны12,13,14,15. Спереди назад, маркеры набираются для, или отмежеваться от, активные зоны распространения волн. Благодаря огнеупорных региона трейлинг активной зоны противоположно направленных волн уничтожить как они встречаются. Распространение волн трансдукции сигнала лежат в основе сотовой выступов, которые посредником миграции клеток10.
Большая часть вышеупомянутой информации о хемотаксис пришли из исследований на социальной амеба сапротрофные discoideum, хотя аналогичные механизмы регулирования, также применимы к нейтрофилов и других клеток млекопитающих типы16 . Сапротрофные устоявшиеся модели организм, который имеет надежную эозинофилов ответ во время голодания, когда тысячи одной клетки мигрируют к агрегации центр, сформировав многоклеточные плодовые тела, содержащие споры. Хемотаксис также важно во время стадии одноклеточных роста этого организма для нахождения бактериальных пищевых источников. Важно отметить, что миграция одиночных клеток сапротрофные удивительно похож на миграции млекопитающих нейтрофилов или метастатического рака клеток, все из которых проходят очень быстро Саркодовые типа миграции. В самом деле общая топология регулирования сети, а также многие из отдельных сигнальных путей участвующих в хемотаксис сохраняются между сапротрофные и млекопитающих лейкоциты17. Кроме того другие клетки, такие как фибробластов, используйте рецепторов тирозин киназ (РТК) вместо GPCR; Однако RTKs может учитываться в подобных сетей.
В отличие от хемотаксис отсутствует глубокое понимание сигнальных механизмов, определяющих различные другие виды режиссер миграции. Аналогичным образом клетки мигрируют в градиенте хемотаксического несколько исследований сообщили активации и/или локализация типичных передовые маркеров, в том числе актина полимеризации, PIP3 и/или внеклеточная сигнала регулируется киназы (Эрк) 1/2, в передней части клеток происходят направлены миграции в ответ на сдвиг потока или изменения электрического поля18,19,,2021. Однако в этих исследованиях непрерывного воздействия на раздражитель также привело к миграции клеток, оставляя открытым вопрос ли, например, маркеры передовые локализовать специально в ответ на раздражитель, или если они просто локализовать на переднем крае из-за увеличения числа ложноножки в передней части миграции клеток.
Мы разработали анализов, которые позволяют нам наблюдать ответ клетки на острый механические возмущения, доставлены как сдвиг потока как на уровне всего населения и как отдельные клетки22. Похож на глобальные стимуляции с хемотаксического, острый stimulaции с потоком ножниц позволяет исследование клеточного ответа на механических стимул без вклада со смешанным от подвижности или полярности. Сочетание этих биохимических и микроскопических анализов с генетических или фармакологических возмущений позволяет нам, чтобы узнать о как механические раздражители воспринимаются и половым путем. Кроме того этот подход также обеспечивает новый метод для задействования системы по течению хемотаксического рецептора в отсутствие хемотаксического, тем самым изолируя сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей от рецепторов/G белка сети.
С помощью методов, описанных ниже мы недавно продемонстрировал, что острый сдвига стресс приводит к активации нескольких компонентов эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей22. Применяя острый механические стимул различные промежутки времени, мы продемонстрировали, что, аналогично chemoattractants, ответ на механических раздражителей также экспонаты особенности возбудимых системы, включая обновляющие поведение ответ под насыщая условия и наличие рефракторного периода. Наконец сочетанием механических и химических стимуляции мы показали, что два стимула разделяют сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей, которые скорее всего позволит для интеграции нескольких стимулы для защиты клеток миграции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0120-17-6</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-445</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P386-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10040525</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Bacto)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-100</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O1728-500</td>
			<td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-680-1100MG</td>
			<td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610610</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610404</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-994-911</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S390-500</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450029</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2060</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-100UL</td>
			<td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>PI46430</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20278</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td>
			<td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene cup (5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13915-985</td>
			<td>Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide with a channel (&#956;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80316</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10978</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&#215;/1.25&#8211;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>DM 16000</td>
			<td>An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021D and 5192000027</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (Femtotip; 1 &#956;m outside diameter, 0.5 &#956;m inside diameter )</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-472</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-338</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software (Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td>
			<td>Gradientech</td>
			<td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td>
			<td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

Хемотаксис, или миграции вверх градиент хемотаксического, это лучше понимать режим режиссер миграции. Исследования с использованием социальных амебы сапротрофные discoideum показали, что сложный сигнал сети трансдукции параллельных путей усиливает ответ на chemoattractants и приводит к предвзятым актина полимеризации и протрузии pseudopod в направление градиента. В противоположность этому молекулярные механизмы, вождение другие виды миграции направлены, например, из-за воздействия сдвига потока или электрического поля, не известны. Многие регуляторы хемотаксис экспонат локализации на ведущих или отставание края миграции клеток, а также показать временные изменения в локализации или активации после глобальной стимуляции с хемотаксического. Чтобы понять молекулярных механизмов других видов направленного миграции мы разработали метод, который позволяет изучение клеточного ответа на острый механической стимуляции, основанные на краткое (2-5 сек) воздействия сдвига потока. Этот стимуляции могут быть доставлены в канале при визуализации ячеек, выражая дневно меченых биодатчики изучить поведение отдельных клеток. Кроме того можно стимулировать популяции клеток в тарелку, анализироваться и immunoblotted, с использованием антител, которые признают активных версий протеинов интереса. Объединив оба анализов, можно изучать широкий спектр молекул, активированную изменения субцеллюлярные локализации и/или фосфорилирования. С помощью этого метода мы определили, что острый механической стимуляции триггеры активации эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей. Возможность изучения клеточных реакций на острый механической стимуляции имеет важное значение для понимания инициатора события, необходимые для потока индуцированного сдвига подвижности. Этот подход также предоставляет инструмент для изучения сети трансдукции эозинофилов сигнала без смешанных влияние хемотаксического рецептора.

Височной ответ регуляторов хемотаксис острой механической стимуляции
Для оценки реакции клеток D. discoideum механическим раздражением, сторонником агрегации компетентных клеток были подвержены краткий импульс потока сдвига. Агрегат?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции

Здесь мы описываем методы для оценки клеточного ответа на острый механической стимуляции. В основе микроскопии assay осматриваем локализации дневно меченых биодатчиков, после краткого стимуляции с потоком ножниц. Мы также тест активации различных протеинов интереса в ответ на острые механической стимуляции биохимически.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

Механическое раздражение Стволовые клетки Использование Циклические одноосной деформации

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Использование optokinetic ответ на исследование зрительной функции данио

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Внутривенно микроинъекции данио рерио Личинки по изучению Острое повреждение почек

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Механическая стимуляция хондроцитов-агарозы Гидрогели

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Агрегацией Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...