Name: preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par les NIH CA109821 (à la STC). Nous remercions Beckman-Coulter pour fournir généreusement des fonds pour couvrir les frais de publication et d’assistance technique à l’installation et le fonctionnement du système élutriation. Nous remercions le Dr Fred Falkenburg fournissant primaire initiale toutes les cultures.

Remarque : ce protocole a été optimisé pour primaire B-toutes les cellules qui vont de diamètre d’environ 8 µm (phase G1) à 13 µm (phases G2/M). Ainsi, la centrifugeuse spécifique des vitesses et les débits pompe peut-être pas applicables aux cellules avec des gammes de tailles différentes. Néanmoins, les paramètres appropriés d’élutriation peuvent être estimées à l’aide de l’équation de vitesse de sédimentation. Les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum défini comme dé...

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	<li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote,+Physarum+polycephalum.">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li><li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda.">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cell+synchronization.">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation.">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li><li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Mitotic+Cell+Synchronization.">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li><li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species.">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation:+recent+developments.">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li><li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Yeast.">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+cells+by+targeting+mitosis.">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li><li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors.">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li><li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perspective+on+old+drugs:+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment.">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li><li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells.">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li><li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors.">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li><li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation.">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li><li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cyclin-dependent+kinases.">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li><li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1.">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li><li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent.">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li><li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells.">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

Nous avons décrit une méthode pour l’obtention de primaire toutes les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à l’aide de la CCE. Dans des conditions optimales une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M pourraient être facilement obtenus avec d’excellents rendements et cellules fortement enrichis en phase S peuvent également être obtenus si vous le souhaitez. Les résultats présentés ici ont été obtenus à ...

Les cellules cultivées généralement croissent de façon asynchrone et des cellules individuelles sont présents dans les différentes phases du cycle cellulaire. Certains organismes présentent naturellement synchrone des cycles cellulaires ou peuvent être synchronisées par des stimuli physiologiques spécifiques. Par exemple, les noyaux dans les plasmodes géants du myxomycète Physarum polycephalum divisent dans un mode très synchrone1et les cellules de l’algue que Desmodesmus quadricauda peuvent être synchronisés par une alternance de lumière et l’obscurité périodes2. Tandis que ces organismes offrent des particularités expérimentales, ils modèle insuffisamment les complexités des cellules de mammifères. La possibilité de synchroniser artificiellement les populations cellulaires de mammifères a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire et la base moléculaire du cycle cellulaire points de contrôle. Méthodes courantes sont la privation de sérum, bloc chimique et libération ou d’exploiter les caractéristiques physiques3,4. Retrait du sérum entraîne souvent des cellules entrer dans le repos, et le rajout du sérum favorise rentrée cycle cellulaire en phase G15. Des inhibiteurs chimiques comprennent des agents tels que la thymidine excessive ou hydroxyurée qui bloquent les cellules à la limite de G1/S ou inhibiteurs de microtubules qui arrêtent généralement les cellules en phase M3,4. Les approches qui exploitent les caractéristiques physiques comprennent mitotique shake-off qui peut être utilisé pour enrichir des cellules mitotiques, car ils sont moins adhérents que de cellules interphasiques6. Cependant, toutes ces techniques présentent des inconvénients potentiels. Par exemple, pas tous les types de cellules maintiennent la viabilité en l’absence de sérum ou de la présence d’inhibiteurs chimiques et le rendement des cellules après que shake arrêt mitotique est limité sans synchronisation préalable avec inhibiteurs mitotiques.
À l’exception des premiers cycles cellulaires embryonnaires, où cellules diminuent progressivement en taille comme ils divisent7, avançant à travers le cycle de la plupart des cellules subissent des phases de croissance et de plus en plus. Cette propriété est exploitée en technique d’élutriation centrifuge contre-courant (CCE), qui peut être utilisée pour séparer les cellules différant par taille et par conséquent au cycle cellulaire phase8,9. Au cours de la CCE, les cellules sont sous l’influence de deux forces opposées : la force centrifuge, qui entraîne les cellules de l’axe de rotation et la vitesse du fluide (contre-courant), qui entraîne les cellules vers l’axe de rotation (Figure 1). Les cellules dans la chambre d’élutriation atteint une position d’équilibre où ces forces sont égales. Les principaux facteurs dictant la position d’équilibre sont la densité et le diamètre de la cellule. Comme l’écoulement de la solution tampon est augmenté et la force de traînée de contre-courant l’emporte sur la force centrifuge, un nouvel équilibre est établi, provoquant un changement dans la position des cellules à l’intérieur de la chambre. Toutes les cellules sont décalés vers la sortie de la chambre, ayant pour résultat plus petits laissant la chambre tout d’abord, alors que les plus grosses cellules restent dans la chambre jusqu'à ce que le taux de contre-courant est augmenté suffisamment pour promouvoir leur sortie. Les cellules s’échappant de la chambre d’élutriation avec hausses consécutives des taux de contre-courant peuvent être collectées dans les fractions spécifiques et chaque fraction contient des cellules de croissance séquentielle de tailles. Au lieu de mener élutriation avec des augmentations des taux de contre-courant, séquentiel diminue en force centrifuge en diminuant la vitesse de centrifugation permettra d’atteindre le même résultat. Le processus d’élutriation nécessite optimisation selon le type de cellule, élutriation tampon employées et l’appareillage spécifique utilisé. Le taux de sédimentation des cellules dans ces conditions est mieux décrit par la Loi de Stokes : SV = [d2ρp- ρ (m) / 18η] .ω2r, où SV = vitesse de sédimentation ; d = diamètre de la particule ; Ρ,p = masse volumique de la particule ; Ρm = masse volumique de la mémoire tampon. Η = viscosité de la mémoire tampon. Ω = vitesse angulaire du rotor ; et r = position radiale de la particule. Ainsi, la SV est proportionnelle à la densité et le diamètre de la cellule, et diamètre étant déclenché à la seconde puissance, elle contribue d’une manière plus significative que la densité qui est généralement constante au cours du cycle cellulaire.
Un avantage important du CCE est que les cellules ne sont pas soumises à des conditions difficiles de traitement chimique ou de la privation alimentaire et peuvent être récupérés avec un excellent rendement essentiellement non perturbée. Une exigence est que les cellules en question subissent une augmentation significative de diamètre, d’au moins 30 %, car ils parcourent le cycle cellulaire. Le principal inconvénient est le coût de la centrifugeuse spécialisée, rotor et accessoires. Néanmoins, la possibilité de préparer les cellules enrichies en phases de cycle de cellules spécifiques par le CCE a grandement facilité les recherche sur le cycle cellulaire chez les organismes de levure en cellules mammifères9,10. Par ailleurs, les avancées récentes élargissent utilisations à la séparation des cellules de sain par rapport aux tissus cancéreux, la séparation des différents types de cellules dans les mélanges hétérogènes et à la production de types spécifiques de cellules pour immunothérapie9.
Notre intérêt majeur a été pour comprendre le mécanisme d’action du microtubule ciblant les agents (MTA) tels que les alcaloïdes de la Pervenche et taxanes. Ces médicaments étaient censés agir exclusivement lors de la mitose, bloquant la fonction de microtubules du fuseau11,12, mais des données récentes suggèrent qu’ils peuvent viser aussi interphase microtubules13,14. Nous avons récemment rapporté que les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë (tous) subissent la mort en soit la phase G1 ou au m phase que traités par vincristine et d’autres MTA dans un cycle cellulaire-dépendant15. La capacité de séparer toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes par le CCE a contribué pour parvenir à cette conclusion. Dans cet article, nous décrire les détails techniques et offrent des conseils pratiques pour l’application du CCE à la préparation des primaires toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">10-508Q</td>
			<td style="width:780px;">1 L bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Fetal Plus bovine serum</td>
			<td style="width:108px;">Atlas Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">FP-0500-A</td>
			<td>500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td>
			<td style="width:108px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">212-672-4</td>
			<td>100 g powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">50 mL concial tubes</td>
			<td style="width:108px;">Denville Scientifics</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td>500/case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PES Membrane 0.22 &#181;m filter unit</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGP033RB</td>
			<td>250/pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B14544</td>
			<td>centrifuge compatible with elutriation system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">JE 5.0 elutriator rotor kit</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356900</td>
			<td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chamber, standard, 4-mL, &#34;A&#34;</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356943</td>
			<td>standard elutriation chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Easy-Load pump head</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07528-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">25 G x 1.5 Precision Glide needle</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305127</td>
			<td>sterile, single-use needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">10 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td>sterile, single-use syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Vi-Cell XR</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">383556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PI/RNase staining buffer</td>
			<td style="width:108px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">550825</td>
			<td>propidium iodide/RNase staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-20044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">8516s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">2118s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

La possibilité de synchroniser les cellules a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire. Les techniques courantes utilisées incluent la privation de sérum ; produits chimiques qui arrêtent les cellules lors des phases d’un cycle cellulaire différent ; ou l’utilisation de mitotique shake-off qui exploite leur adhérence réduite. Cependant, tous ces ont des inconvénients. Par exemple, la privation de sérum fonctionne bien pour les cellules normales, mais moins bien pour les cellules de la tumeur avec compromis cell cycle points de contrôle en raison de l’oncogène activation ou tumor suppressor perte. De même, populations cellulaires traité chimiquement peuvent abriter des dommages causés par les drogues et montrent des altérations liées au stress. Une technique qui contourne ces problèmes est élutriation centrifuge contre-courant (CCE), où les cellules sont soumis à deux forces opposées, la force centrifuge et vitesse du fluide, qui se traduit par la séparation des cellules sur la base de la taille et la densité. Étant donné que les cellules avançant à travers le cycle typiquement agrandir, CCE peut être utilisé pour séparer les cellules en phases de cycle de cellules différentes. Ici, nous appliquons cette technique à des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë primaire. Dans des conditions optimales, une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M peuvent être obtenus avec un excellent rendement. Ces populations de cellules sont idéales pour étudier des mécanismes dépendants du cycle cellulaire d’action des médicaments anticancéreux et pour d’autres applications. Aussi, nous montrent comment les modifications à la procédure standard peut provoquer des performances sous-optimales et discuter les limites de la technique. La méthodologie détaillée présentée devrait faciliter l’application et à l’exploration de la technique à d’autres types de cellules.

Primaire toutes les cellules (3-4 x 108) ont été soumis à élutriation centrifuge et recueilli dans deux fractions de lavage et vingt principales fractions, comme décrit dans le protocole. Le tableau 1 montre les données représentatives où le nombre total de cellules dans chacune des fractions ainsi que la vitesse du rotor correspondantes est présenté. Dans l’ensemble rendement dépassait généralement 80 %. Mesure du diamètre des cellules dans les différentes fra...

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Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

The overall goal of this procedure, is to isolate cells into different cell cycle phases using centrifugal elutriation. This method can help answer key questions in the cancer therapeutics field. Because the isolation of cells into separate phases, allows for the interrogation of phase dependent affects of anti-cancer compounds.The main advantage of this technique is that it allows for separation of cells into specific phases using physical properties, rather than chemical perturbations. To start the experiment, install the strobe assembly into the centrifuge such that the power cord is fed out of the chamber through the port on the left. Adjust the strobe flash lamp so that it lines up with the viewing window, when the centrifuge is closed.Secure the assembly in place, by tightening two phillips head screws, at the top of each bracket. And then by tightening the thumb screws at the bottom of the bracket. Plug the power cord into the strobe power port, located at the back of the centrifuge.Next, set the rotors straight down onto the centrifuge drive hub, and firmly secure it with a T handle hex wrench. Then, place the assembly containing the elutriation chamber, counterbalance, rotating seal assembly, and a mounting plate onto the rotor. Push down evenly, placing one hand on the elutriation chamber, and the other hand on the counterbalance, until the bolts on the rotor snap into place.Place the pin, located at one end of the cable, into the hole in the rotating seal assembly. And secure the eyehole, at the other end, with one of the phillips head screws, affixed onto the bracket to connect the anchoring cable. To assemble the flow system, to pump buffer into and out of the elutriation chamber, connect size 16 tubing to a variable speed pump.Insert one free end of this tubing through a port at the top left of the centrifuge chamber, such that it enters into the chamber. Attach a fitting to the free end of this tube, and then insert the fitting into the input hole of the rotating seal assembly. Lastly, insert the output tubing, through a port, to attach it to the transfer tube at the top of the rotating seal assembly.Once the elutriation system is assembled, sterilize it by placing the other free end of the input tubing into a 500 milliliter bottle, filled with 5%bleach. And placing the output tubing into an empty one liter waste bottle. Next, turn on the pump, and allow the bleach to flow all the way through the elutriation system, until it is pumped out into the waste bottle.Now, turn the centrifuge on and allow it to come to the maximum designated speed to release bubbles and back pressure. Once the set speed is reached, stop the centrifuge. After the rotor has stopped completely, open the lid and inspect the chamber for any leaks.Next, in a similar fashion, as previously described, run sterile water through the system for 10 minutes. After flushing with water, replace the water reservoir with a sterile glass bottle filled with 100 milliliters of elutriation buffer. Place the input tubing into this bottle, so that it is at the very bottom.Start the centrifuge, and allow the buffer to flow through the system. After the reservoir bottle is close to empty, and water is fully flushed out of the system, move the output tubing from the waste bottle into the reservoir so that buffer is continuously recycled through the system. Finally, switch on the strobe lamp, and turn the elutriation knob to the extreme left.Now, adjust the viewing window by slowly turning the knob to the right, so that the elutriation chamber is clearly seen, and the strobe light is in sync with the rotor's speed. Prepare the cell sample as described in the text protocol. Add the resuspended cells into the reservoir bottle containing the recycling elutriation buffer.Allow the cells to enter into the system and reach equilibrium within the elutriation chamber. To ensure that all cells are retained in the chamber, take a drop of the eluent on a glass slide, and view it under a microscope. If the sample is devoid of intact cells, it confirms the retention in the chamber.Once all the cells have entered into the chamber, and a distinct boundary at the whitest part of the chamber, containing cells and equilibrium is seen, begin collecting fractions. Move the output tubing to a pre-chilled 50 milliliter conical tube, labeled W1.Collect 50 milliliters of elutriation buffer in this tube and store on ice. Soon after collecting the W1 fraction, lower the centrifuge speed to 821 G.And move the output tube to the conical tube, labeled W2, and collect 50 milliliters more at this speed.Continue changing the speed, and collecting fractions. Make sure there is medium in the reservoir tank, and always store the collected fractions on ice. After all fractions have been collected, stop the centrifuge, and collect 50 milliliters in a conical tube, labeled stop.Pellet cells collected in each of the fractions, and using downstream analysis, such as flow cytometry, or western blotting, as required. A line graph displaying the average diameter of cells in successive elutriation fractions, is shown. Note that the larger the cell diameter, the higher the fraction number at which it elutes.Results from fluorescents activated cells sorting analysis, show the DNA content of cells in each of the 20 elutriation fractions. Early fractions, F1 to F5, contain almost exclusively cells with 2N DNA content representing cells in G1 phase. A mixture of cells in G1 and S phases, was seen in intermediate fractions, F6 to F9.And cells with 4N DNA content, representing cells in G2 to M, were observed starting in F10.Shown here, are western blot results from probing the levels of cell cycle related proteins in pooled fractions of cells in G1 phase, and G2 to M phase. The G2 to M Pool had higher levels of Phospho-Rb and Cyclin B one, compared to the G1 Pool, as expected. Cyclin D one signal was weak, but nonetheless was detectable in the G1 Pool, and undetectable in the G2 to M Pool.Once mastered, this technique can be done in three hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to take your time, and make sure that the elutriation system is assembled properly, and that all materials and solutions are prepared. Following this procedure, other methods such as cell cycle analysis, cell viability assays and immunoblots can be performed in order to interrogate how therapeutic compounds may be acting in a cell cycle phase dependent manner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...