Name: assay development for high content quantification of sod1 mutant protein aggregate formation in living cells
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل بمنحه ممولة من الحكومة الكورية (مسيب) (جبهة الخلاص الوطني-2014K1A4A7A01074642)، وبرنامج دعم العلماء الفردية الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) (جبهة الخلاص الوطني-2013M3A9B5076486/جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A09057239).

1-إنتاج lentivirus ملاحظة: إنتاج والتلاعب المتجهات لينتيفيرال نفذت وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث التي تشمل المؤتلف المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الحمض النووي. بلازميد الترميز البرية من نوع والمسخ A4V SOD1 المفتاحية يفب المحسن (SOD1WT-يفب و SOD1A4V-يفب) وصف كيم وآخرون. 11 كلا ا...

<ol>
	<li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington's+disease+model.">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).</li><li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer's+disease.">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li><li>Burkhardt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+model+for+sporadic+ALS+using+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).</li><li>Mattiazzi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Screening+for+Quantitative+Cell+Biology.">High-Content Screening for Quantitative Cell Biology.</a> Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).</li><li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+models+and+human+neuropathology:+Similarities+and+differences.">Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences.</a> Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).</li><li>Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis:+a+proteinopathy?.">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?.</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li><li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als.">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li><li>Vassall, K. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS.">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li><li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper/zinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization,+Oligomerization,+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper/Zinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells.">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li><li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length,+unmodified+superoxide+dismutase-1.">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li><li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis:+Mutations+and+oligomerization.">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li><li>Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu,+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li><li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+mediates+aggregation,+toxicity,+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1.">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li><li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis:+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu,Zn+superoxide+dismutase.">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li><li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li><li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown.">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34+-Derived+Hematopoietic+Cells,+Including+Developing+T+Cells+and+NOD/SCID+Mouse+Repopulating+Cells,+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors.">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li><li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages.">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li><li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+nuclei+detection,+segmentation,+and+classification+in+digital+histopathology:+A+review-current+status+and+future+potential.">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li><li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li><li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage.">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li><li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+arimoclomol,+a+coinducer+of+heat+shock+proteins,+delays+disease+progression+in+ALS+mice.">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li></ol>

وهناك نهجين رئيسيين لتوليد خطوط الخلايا مستقرة. يستغرق عدة أسابيع الأولى ويتطلب التحديد تعداء ومقاومة عابرة موجهات الدنا الجينومي بلازميد المتكاملة. الثاني يأخذ بضع ساعات من خلال استخدام lentivirus، مما يجعل هذا البروتوكول قابلاً للتعبير الفعال عن البروتين المستهدف في عدة أسطر الخلية مع جهد...

يتم تجميع البروتين تجمعات مجموعة البروتينات تصل عملية بيولوجية من خلالها وقد تكون بمثابة العوامل المسببة في أمراض الأعصاب (الداء النشواني). وصف تجميع البروتين ضروري لفهم دور المجاميع في خلل الخلوية، وكذلك كما هو الحال في تسهيل اكتشاف العوامل الجديدة التي تؤثر في ظهور الأمراض. التصور من معلم fluorescence البروتينات في الخلايا الحية هي طريقة قوية والتي قد تساعد في تطوير فحوصات تنطبق على المحتوى العالي من الفحص (HCS)1،2،،من34.
ويعتبر التصلب العضلي الجانبي (المرض) مرض بروتيوباثيك الناجمة عن وجود تجمعات البروتينات مع الميل إلى تجميع وتتراكم في الخلايا العصبية الحركية في ALS الأسرية (مارا) ومتفرقة ALS (قرضاً)5،6 . وترتبط مجموعة فرعية من ~ 20% حالات مارا مع المهيمنة الطفرات في الجينات ترميز الإنزيم سيتوسوليك المضادة للأكسدة اكتب الفاءق فائق أكسيد النحاس والزنك (SOD1) 17،8. قد اقترحت العديد من الأسباب المحتملة لهذا الخلل وراثيا المشتقة، بما في ذلك التغيرات في هيكل ووظيفة SOD1 المتغيرات، مثل الاستقرار الشاذة، وزيادة معدل تطور، والميل إلى إجمالي9، 10. جدير بالذكر أن الخاصية تم التحقق منها ويمكن أن تكون سامة فقط مشتركة بين كلا الخيارين SOD1 المرتبطة بالمرض والبرية من نوع (WT) SOD1 ميل المتزايد إلى تشكيل المجاميع البروتين مجزأة أو تضمينات البروتينية11،12 . هو إصرار بوليوبيكويتيناتيد المسخ تجمعات SOD1، وتدهورت بسبب نظام ubiquitin-بروتوزوم. نتيجة لذلك على مستوى منخفض من تثبيط النشاط بروتوزوم يؤدي إلى تراكم متحولة SOD1 المجاميع13،14، أي تشكيل هياكل غير متبلور تتألف من مكونات قابلة للذوبان التي يمكن أن تتبادل مع القابلة للذوبان متحولة SOD1 في سيتوسول15. في طافرة SOD1 خاصة، A4V (ألانين في كودون 4 تغيرت إلى فالين) هو الطفرة المسببة للمرض الأكثر شيوعاً، ويؤدي إلى نيوروديجينيريشن السريع مع وقت متوسط البقاء على قيد الحياة أقل من 2 سنوات بعد ظهور المرض16. وقد SOD1 A4V المتحلل، ميل متزايد مونوميريزي وتجميعها وتشكيل المسام اميلويد؛ تتشابه مجاميعه مثل المسام المسام اميلويد أخرى أشكال سلاحف المرتبطة بالمرض، مثل α-سينوكلين وبيتا-اميلويد بروتين17. دراسة ديناميات تراكم SOD1 المجمعة، تظل أساليب لرصد أشكال SOD1 الإجمالية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان التي ستوضع.
أننا أظهرنا سابقا، باستخدام التصوير بخلية يعيش و transfected الخلايا HEK-293 عابر مع نيون SOD1 معلم البروتين، أن الطفرات المرتبطة بالمرض يضر SOD1 ثنائي وتجميع11. على الرغم من أن أنظمة تعبير عابر يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن نتائج قصيرة الأجل الجينات overexpression البيولوجية، قد تكون أساليب توفير تكامل مستقرة من الجينات المرغوبة المفضل للتنمية المقايسة. على هذا النحو، تقدم ناقلات لينتيفيرال القدرة على إضفاء تعبير الجينات الطويلة الأجل والتنظيم في خلايا الثدييات 18. في هذه الدراسة، ركزنا على توليد خطوط الخلايا مستقرة ترانسدوسيد مع المؤتلف lentivirus تحمل وزن والمسخ SOD1 المفتاحية بروتين فلوري الصفراء (يفب). استخدام خلية يعيش التصوير المجهري والكمي الآلي لتجميع SOD1، آثار وكمياً SOD1 تجميع الأحداث على تثبيط بروتوزوم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ALLN (C20H37N3O4)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>208719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132 (C26H41N3O5)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxomicin (C28H50N4O7)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H-3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera EvoShell software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 1.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OPRT1288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony Imaging software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 3.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 2.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyBi Hummingwell liquid handling</td>
			<td>CyBio AG</td>
			<td>OL 3387 3 0110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay development for high content quantification of sod1 mutant protein aggregate formation in living cells

التصلب العضلي الجانبي (المرض) هو مرض الأعصاب قاتلة التي يمكن أن تسببها الطفرات موروثة في الجينات ترميز فائق أكسيد النحاس والزنك الفاءق 1 (SOD1). حالة عدم الاستقرار الهيكلي من SOD1 والكشف عن تضمينات SOD1 إيجابية في المرضى الذين يعانون المرض الأسرية تؤيد دور سببية محتملة SOD1 تجمعات و/أو مجمعة في باثولوجيا المرض. في هذه الدراسة، يصف لنا تطوير التحليل يستند إلى الخلية مصممة لقياس القوى المحركة لتجميع SOD1 في الخلايا الحية بالمحتوى العالي من فحص النهج. استخدام ناقلات لينتيفيرال، ونحن إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن SOD1 A4V البرية من نوع ومتحولة معلم مع بروتين فلوري الصفراء، وتبين أن كلا من البروتينات وأبديت في سيتوسول دون أي بادرة للتجميع. من المثير للاهتمام، فقط SOD1 A4V ستابلي المعرب عنها في HEK-293، ولكن ليس في خطوط الخلايا U2OS أو SY5Y ش، شكلت المجاميع عند بروتوزوم مثبط للعلاج. ونحن تبين أنه من الممكن للتحديد الكمي للتجميع على أساس تحليل الجرعة والاستجابة لمختلف بروتوزوم مثبطات، وتتبع الحركية الكلية لتشكيل بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري. ويدخل نهجنا إمكانية التحديد الكمي لأثر حدوث طفرات المرض على الدور SOD1 في تشكيل إجمالي، فضلا عن الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تحول دون تجميع SOD1 A4V.

خط الخلية مستقرة المدرة باستخدام لينتيفيروس: الاستراتيجية العامة لرصد المجاميع البروتين SOD1 يتضح في الشكل 1. في خطوة أولى، ونحن إنشاء ناقل تعبير لينتيفيرال لإيصال الجينات مستقرة SOD1 في خطوط الخلايا (الخطوة 1). بين الموجهات لينتيفيرال ترميز المعلمة...

Watch this Scientific Journal Video about Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells at JoVE.com

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

يصف لنا طريقة للتحديد الكمي لتجميع البروتينات تجمعات. لدينا تفاصيل البروتوكول لينتيفيرال الناجمة عن توليد خط الخلية مستقرة والتصوير الآلي [كنفوكل]، وتحليل الصور من المجاميع البروتين. كتطبيق توضيحية، قمنا بدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة في تشجيع تجميع SOD1 بطريقة تعتمد على وقت وجرعة.

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

The overall goal of this experiment is to develop an assay for studying the effect of small molecules in modulating the aggregation of misfolded proteins in a time and dose dependent manner. This method can help answer the key questions for development of cellular assay, and it's use is for high-content screening techniques. The main advantage of this technique is to provide a simple method to detect and quantify protein aggregation occurring in several neurodegenerative disorders.The implication of this technique extends towards potential therapy of neurodegenerative diseases, such as ALS, because it proposes a simple method that allow to develop cellular assay and perform screening for small molecule moderators. To start virus production, prior to plasmid transfection split HEK-293 T-cells at 30 to 40%confluence in a 10 centimeter tissue culture dish and 10 milliliters of cell culture medium. Incubate the culture plate in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius overnight.On the following day, prepare DNA transfection solution with packaging plasmids lentiviral vector, 125 microliters of one molar calcium chloride and add distilled water to adjust the volume to 500 microliters. Gently add 500 microliters of 0.05 molar HEPS buffer and incubate for 10 minutes at room temperature. After that, replace HEK-293 T-cell medium with 10 milliliters pre-warmed antibiotic-free fresh culture medium mixed with one milliliter of DNA transfection solution.Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide incubator over night. Replace cell supernatent with fresh culture medium on the following day and incubate again overnight. Finally, on the following day harvest the supernatent and transfer to a 15 milliliter tube.To remove the dead cells and debris, centrifuge the tube at 500 times g for five minutes. To further purify the supernatent, pass it through a 0.45 micrometer filter using a 60-milliliter syringe. Then, immediately dispense the filtered supernatent into 300-microliter single use aliquots.To prepare the cells for transduction, split them to be infected at 60%confluence in a six-well tissue culture plate in two milliliters of DMAM supplemented with 10%FBS. Incubate the cells in a 37-degree Celsius incubator at 5%carbon dioxide overnight. On the following day, thaw one aliquot of the frozen lentivirus on ice for each use.Meanwhile, warm the cell culture medium containing the serum compatible with the cell line of interest. Once the virus is fully thawed, dilute it in DMEM in new 1.5 milliliter micro-centrifuge tubes. Then adjust the volume to one milliliter with reduced serum medium.Next, add two microliters of polybrene to one milliliter of virus per medium and mix well by pipetting. Add one milliliter of this mixture to the cells and incubate at 37 degrees Celsius for 24 hours. After incubation, remove the virus containing medium and replace it with normal DMEM supplemented with 10%FBS and return the cells to the incubator.Monitor the cell growth and change the medium every two days When the cells reach confluence, expand each well of the six-well dish into a 10-centimeter tissue culture plate. Move the plates to the incubator. Finally, save 1.5 times 10 to the 4th cells per well and 50 microliters of DMEM on 384 well assay plates.Then check the expression level of the YFP-tagged protein under the microscope. If the expression shows signal-to-noise ratio equal or greater than three, prepare cell stock for the corresponding cell line. For the compound transfer, on a 384-well storage polypropylene plate, add serial dilutions of compounds by the standard one to three dilution series.Then, using a liquid handler equipped with a 384-capillary head, distribute 0.25 microliters of proteasome inhibitors on empty, flat-bottomed black 384-well assay plates. Then seed 1.5 times 10 to the 4th cells on these plates. Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours.Prior to imaging the cell line treated with proteasome inhibitors, add 10 microliters of pre-warmed DMEM with staining solution and incubate at room temperature for 10 minutes. After staining, start the automated microscope operating software by selecting the microscope tab. First, select the configuration tab and then select 20 times objective in the correct plate type.To allow proper focus with different plate types, make sure that the caller is set to the correct value on the objective. Next, select exposure one. Set focus height to zero micrometers, then select focus.Once it is focused, expose camera one. To optimize the exposure plane, adjust the focus height and click on take height. Change exposure times and laser power for a maximum pixel intensity of approximately 3000 and save exposure parameters.Select experiment definition tab, create a layout and sublayout. Next, drag and drop the relevant layout exposure, reference image, skew crop file, and sublayout. Then, save the experiment.Finally, select automatic experiment tab and acquire images. For two-channel images, first select the software algorithm to segment the primary objects, such as nuclei, cytosol, and aggregates. First, distribute 0.25 microliters of proteasome inhibitor dissolved in 100%DMSO or DMSO on 384-well flat-bottomed plates.On the same plate, manually seed 1.5 times 10 to the 4th cells per well in 50-microliters of DMEM. Then set up the microscope system environmental control unit to 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Operate the microscope in wide-field florescence mode and as software settings, choose LWD 20 times objective non-confocal mode, four fields per well, and capture interval of one hour.Then, select the appropriate algorithm to segment the primary object such as cytosol and aggregates. Adjust background threshold and contrast parameters if required. The tested cell lines transduced with SOD-1 wild type and SOD-1 A4V mutant remained healthy, showed high expression levels, and longterm wide phi-labeling irrespective of the SOD form.Treatment with proteasome inhibitor ALLN for 24 hours promoted the accumulation of SOD-1 A4V YFP aggregates in HEK-293 cells but not in SOD-1 Wild Type YFP transduced cells. Furthermore, there were very low levels of aggregation in U2 OS and SH-SY5Y cell lines SOD-1 A4V YFP transduced with the same vectors. After seeding the cells in the presence or absence of ALLN, they were monitored for aggregate formation for a period of 50 hours.ALLN aggregate formation reached a plateau at 24 hours and remained stable over the next 12 hours. Furthermore, cell density significantly decreased after 28 hours as a result of the cytotoxic effect of ALLN, while cell number increased in the DMSO-treated negative control. SOD-1 A4V YFP cells cultured in the presence of proteasome inhibitors for 24 hours were stained with Hoechst solution.The relative toxicity for three different proteasome inhibitors was quatified by measuring the number of adherent cell lines remaining in the well labeled with Hoechst dye. The total cell number decreased in response to increased dose of protease inhibitors. Inversely, the percentage of cells expressing SOD-1 A4V aggregates increased with the concentration of protease inhibitor.When doing this process it is important to remember that the cell quality will drastically influence your result. So it's important to determine that the cells are microplasma free and are healthy all along the steps. Following this process, another imaging method can be used in order to answer additional questions regarding the degradation of protein or the interaction of the protein with others using resonance energy transfer.After watching this video, you should have a good understanding of how to generate the tools to test the fate of protein in multiple living cells using high-content image analysis. So this method can provide insight into protein aggregation as it occurs in simple cellular models. It can also be applied to other systems such as neuron differentiated from patient specific induced pluripotent stem cells.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

إعداد يعيشون معزولين خلايا مستقبلة للضوء الفقارية للتصوير الإسفار

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

الفحص مباشرة للالكمي لتجنب الاجتماعي في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

عالية الدقة الكمي للسلوك رائحة الموجهة في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; استخدام<em&gt; Flywalk</em&gt; بارادايم

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

تحليل الفائق للسلوك الحركي في مقايسة الجزيرة المورفولوجية

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...