Name: assay development for high content quantification of sod1 mutant protein aggregate formation in living cells
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2014K1A4A7A01074642), והתוכנית הלאומית מחקר קרן של קוריאה (NRF) מדען בודדים תמיכה (ה-NRF-2013M3A9B5076486/ה-NRF-2015R1D1A1A09057239).

1-הפקה lentivirus הערה: הייצור ואת מניפולציה של וקטורים lentiviral בוצע על פי הנחיות הלאומית המכונים לבריאות (NIH) למחקר מעורבים רקומביננטי ה-DNA. פלסמיד קידוד פראי-סוג של מוטציה A4V SOD1 המתויגת YFP משופרת (SOD1WT-YFP ו SOD1A4V-YFP) מתוארים קים ואח. 11 שני המוצרים פיוז'ן ג'ין היו מוגבר בא...

<ol>
	<li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington's+disease+model.">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).</li><li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer's+disease.">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li><li>Burkhardt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+model+for+sporadic+ALS+using+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).</li><li>Mattiazzi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Screening+for+Quantitative+Cell+Biology.">High-Content Screening for Quantitative Cell Biology.</a> Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).</li><li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+models+and+human+neuropathology:+Similarities+and+differences.">Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences.</a> Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).</li><li>Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis:+a+proteinopathy?.">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?.</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li><li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als.">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li><li>Vassall, K. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS.">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li><li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper/zinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization,+Oligomerization,+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper/Zinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells.">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li><li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length,+unmodified+superoxide+dismutase-1.">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li><li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis:+Mutations+and+oligomerization.">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li><li>Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu,+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li><li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+mediates+aggregation,+toxicity,+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1.">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li><li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis:+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu,Zn+superoxide+dismutase.">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li><li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li><li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown.">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34+-Derived+Hematopoietic+Cells,+Including+Developing+T+Cells+and+NOD/SCID+Mouse+Repopulating+Cells,+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors.">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li><li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages.">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li><li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+nuclei+detection,+segmentation,+and+classification+in+digital+histopathology:+A+review-current+status+and+future+potential.">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li><li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li><li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage.">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li><li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+arimoclomol,+a+coinducer+of+heat+shock+proteins,+delays+disease+progression+in+ALS+mice.">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li></ol>

ישנן שתי גישות עיקריות ליצירת שורות תאים יציב. הראשון לוקח מספר שבועות ומחייב בחירה תרביות תאים והתנגדות ארעית של הווקטורים דנ א גנומי פלסמיד משולב. השני לוקח שעות באמצעות lentivirus, ביצוע פרוטוקול זה נוטה הביטוי יעיל של חלבון המטרה שורות תאים מרובים עם מאמץ מוגבל. הטיול-CMV וקטור19...

צבירת חלבון היא תהליך ביולוגי שבו misfolded קבוצת חלבונים את רשאית לפעול כסוכני סיבתי מחלות ניווניות (עמילואידוזיס). אפיון צבירת חלבון חיוני להבין את התפקיד של אגרגטים הסלולר בתפקוד לקוי גם הכוונה להקל על גילוי חדש גורמים המשפיעים על הופעת המחלה. הפריט החזותי של קרינה פלואורסצנטית מתויג חלבונים בתאים חיים היא שיטה חזקה אשר עשויים לסייע בפיתוח של מבחני החלים על תכולה גבוהה הקרנת3,2,1,(HCS)4.
נוירודגנרטיביות (ALS) נחשבת מחלה proteopathic הנגרמת על ידי נוכחותם של חלבונים misfolded עם נטיה לצבור ולצבור בנוירונים מנוע ALS משפחתית (fALS) והן סדיר ALS (sALS)5,6 . תת-קבוצה של ~ 20% מהמקרים fALS קשורים עם דומיננטי מוטציות בגן קידוד האנזים נוגד חמצון cytosolic אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז להקליד (SOD1) 17,8. הוצעו מספר סיבות פוטנציאליות בתפקוד נגזר גנטית זו, לרבות שינויים המבנה והתפקוד של SOD1 משתנים, כגון יציבות סוטה, קצב התגלגלות מוגבר נטיה לצבור9, 10. ראוי לציין, המאפיין היחידי מאומת, רעיל המשותפים לשני החלקים SOD1 מקושרים-ALS ופראי-סוג (WT) SOD1 היא נטיה מוגברת אגרגטים חלבון ממודר או הכללות proteinaceous11,12 . מוטציה misfolded SOD1, בהתמדה polyubiquitinated, מושפל על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כתוצאה מכך, רמה נמוכה של עיכוב פרוטאוזום הפעילות מוביל להצטברות של SOD1 אגרגטים13,14, מבנים אמורפיים איזה טופס המורכבת מרכיבים מסיסים שבו אפשר להחליף עם מוטציה מסיסים SOD1 המוטנט ציטוזול15. ב בפרט, SOD1 המוטנט A4V (אלנין-codon 4 שינתה ולין) המוטציה השכיחה ביותר הגורמים ALS, והוא מוביל הקשורים ניוון מוחיים מהירה עם מועד הישרדות ממוצע של פחות משנתיים לאחר התפרצות המחלה16. מבחינה ביוכימית, SOD1 A4V יש נטייה מוגברת monomerize, צבירה, ויוצרים נקבוביות עמילואיד; אגרגטים כמו נקבוביות שלה דומים נקבוביות עמילואיד מקושרים-מחלת מוטציה צורות אחרות, כגון חלבון α synuclein וβ-עמילואיד17. ללמוד את הדינמיקה של הצטברות SOD1 צבירה, שיטות לניטור מסיסים ובחלקם לא מסיסים SOD1 צבירה טפסים להישאר להיות מפותח.
הראינו בעבר, באמצעות הדמיה לחיות תאים, התאים HEK-293 transiently transfected עם פלורסנט SOD1 מתויג חלבון, כי מוטציות הקשורות ALS לפגום dimerization של צבירת SOD111. למרות מערכות ביטוי ארעי יכול לספק מידע שימושי על התוצאה הביולוגי של ביטוי גנים לטווח קצר, שיטות מתן יציב שילוב של גנים הרצוי עשוי להיות מועדפת לפיתוח וזמינותו. ככזה, וקטורים lentiviral מציעים את היכולת להתייעץ ביטוי גנים לטווח ארוך ומוסדרת על תאים בתרבית של 18. במחקר זה, התמקדנו הדור של שורות תאים יציב transduced עם lentivirus רקומביננטי הנושאת WT ו מתויג SOD1 המוטנט עם חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות תאים כימות אוטומטיות של צבירת SOD1, אנו מופעלות, לכמת SOD1 צבירת להתרחשויות עיכוב של פרוטאוזום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ALLN (C20H37N3O4)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>208719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132 (C26H41N3O5)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxomicin (C28H50N4O7)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H-3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera EvoShell software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 1.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OPRT1288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony Imaging software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 3.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 2.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyBi Hummingwell liquid handling</td>
			<td>CyBio AG</td>
			<td>OL 3387 3 0110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay development for high content quantification of sod1 mutant protein aggregate formation in living cells

נוירודגנרטיביות (ALS) היא מחלה קטלנית ניווניות יכול להיגרם על-ידי מוטציות בירושה ג'ין קידוד אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). את חוסר היציבות מבנית של SOD1, זיהוי תכלילים SOD1-חיוביות בחולי ALS משפחתית תומכת תפקיד סיבתי פוטנציאליים עבור SOD1 misfolded ו/או צבורים בפתולוגיה ALS. במחקר זה, אנו מתארים את התפתחות assay מבוססת תא שעיצב לכמת את הדינמיקה של צבירת SOD1 בתאים חיים תכולה גבוהה ההקרנה גישות. באמצעות וקטורים lentiviral, יצרנו שורות תאים יציב לבטא פראי-סוג של מוטציה SOD1 A4V עם חלבון פלואורסצנטי צהוב התגית ומצא כי שני חלבונים היו לידי ביטוי ציטוזול בלי שום סימן של מצבור. מעניין, רק SOD1 A4V stably לידי ביטוי HEK-293, אבל לא בשורות תאים U2OS או SH-SY5Y, יצרו אגרגטים על טיפול מעכבי פרוטאוזום. אנו מראים שאפשר לכמת צבירת מבוסס על ניתוח מנה-תגובה של מעכבי פרוטאוזום שונים, וכדי לעקוב אחר קינטיקה צבירה-היווצרות על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. הגישה שלנו מציג את האפשרות של לכימות ההשפעה של מוטציות ALS על עצמו את התפקיד של SOD1 במבנה הצבירה, כמו גם הקרנת עבור מולקולות קטנות למנוע צבירת SOD1 A4V.

Generating תא יציב קו באמצעות lentivirus: האסטרטגיה הכוללת עבור ניטור אגרגטים חלבון SOD1 מודגם באיור1. צעד ראשון, אנחנו שנוצר וקטור ביטוי lentiviral למסירה יציב הגן SOD1 לתוך שורות תאים (שלב 1). שני וקטורים lentiviral קידוד מתויג YFP SOD1 WT ו SOD1 A4V (SOD1WT-YFP ו- SOD1A4V-YFP, בהתאמה) עם ארי...

Watch this Scientific Journal Video about Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells at JoVE.com

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

The overall goal of this experiment is to develop an assay for studying the effect of small molecules in modulating the aggregation of misfolded proteins in a time and dose dependent manner. This method can help answer the key questions for development of cellular assay, and it's use is for high-content screening techniques. The main advantage of this technique is to provide a simple method to detect and quantify protein aggregation occurring in several neurodegenerative disorders.The implication of this technique extends towards potential therapy of neurodegenerative diseases, such as ALS, because it proposes a simple method that allow to develop cellular assay and perform screening for small molecule moderators. To start virus production, prior to plasmid transfection split HEK-293 T-cells at 30 to 40%confluence in a 10 centimeter tissue culture dish and 10 milliliters of cell culture medium. Incubate the culture plate in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius overnight.On the following day, prepare DNA transfection solution with packaging plasmids lentiviral vector, 125 microliters of one molar calcium chloride and add distilled water to adjust the volume to 500 microliters. Gently add 500 microliters of 0.05 molar HEPS buffer and incubate for 10 minutes at room temperature. After that, replace HEK-293 T-cell medium with 10 milliliters pre-warmed antibiotic-free fresh culture medium mixed with one milliliter of DNA transfection solution.Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide incubator over night. Replace cell supernatent with fresh culture medium on the following day and incubate again overnight. Finally, on the following day harvest the supernatent and transfer to a 15 milliliter tube.To remove the dead cells and debris, centrifuge the tube at 500 times g for five minutes. To further purify the supernatent, pass it through a 0.45 micrometer filter using a 60-milliliter syringe. Then, immediately dispense the filtered supernatent into 300-microliter single use aliquots.To prepare the cells for transduction, split them to be infected at 60%confluence in a six-well tissue culture plate in two milliliters of DMAM supplemented with 10%FBS. Incubate the cells in a 37-degree Celsius incubator at 5%carbon dioxide overnight. On the following day, thaw one aliquot of the frozen lentivirus on ice for each use.Meanwhile, warm the cell culture medium containing the serum compatible with the cell line of interest. Once the virus is fully thawed, dilute it in DMEM in new 1.5 milliliter micro-centrifuge tubes. Then adjust the volume to one milliliter with reduced serum medium.Next, add two microliters of polybrene to one milliliter of virus per medium and mix well by pipetting. Add one milliliter of this mixture to the cells and incubate at 37 degrees Celsius for 24 hours. After incubation, remove the virus containing medium and replace it with normal DMEM supplemented with 10%FBS and return the cells to the incubator.Monitor the cell growth and change the medium every two days When the cells reach confluence, expand each well of the six-well dish into a 10-centimeter tissue culture plate. Move the plates to the incubator. Finally, save 1.5 times 10 to the 4th cells per well and 50 microliters of DMEM on 384 well assay plates.Then check the expression level of the YFP-tagged protein under the microscope. If the expression shows signal-to-noise ratio equal or greater than three, prepare cell stock for the corresponding cell line. For the compound transfer, on a 384-well storage polypropylene plate, add serial dilutions of compounds by the standard one to three dilution series.Then, using a liquid handler equipped with a 384-capillary head, distribute 0.25 microliters of proteasome inhibitors on empty, flat-bottomed black 384-well assay plates. Then seed 1.5 times 10 to the 4th cells on these plates. Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours.Prior to imaging the cell line treated with proteasome inhibitors, add 10 microliters of pre-warmed DMEM with staining solution and incubate at room temperature for 10 minutes. After staining, start the automated microscope operating software by selecting the microscope tab. First, select the configuration tab and then select 20 times objective in the correct plate type.To allow proper focus with different plate types, make sure that the caller is set to the correct value on the objective. Next, select exposure one. Set focus height to zero micrometers, then select focus.Once it is focused, expose camera one. To optimize the exposure plane, adjust the focus height and click on take height. Change exposure times and laser power for a maximum pixel intensity of approximately 3000 and save exposure parameters.Select experiment definition tab, create a layout and sublayout. Next, drag and drop the relevant layout exposure, reference image, skew crop file, and sublayout. Then, save the experiment.Finally, select automatic experiment tab and acquire images. For two-channel images, first select the software algorithm to segment the primary objects, such as nuclei, cytosol, and aggregates. First, distribute 0.25 microliters of proteasome inhibitor dissolved in 100%DMSO or DMSO on 384-well flat-bottomed plates.On the same plate, manually seed 1.5 times 10 to the 4th cells per well in 50-microliters of DMEM. Then set up the microscope system environmental control unit to 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Operate the microscope in wide-field florescence mode and as software settings, choose LWD 20 times objective non-confocal mode, four fields per well, and capture interval of one hour.Then, select the appropriate algorithm to segment the primary object such as cytosol and aggregates. Adjust background threshold and contrast parameters if required. The tested cell lines transduced with SOD-1 wild type and SOD-1 A4V mutant remained healthy, showed high expression levels, and longterm wide phi-labeling irrespective of the SOD form.Treatment with proteasome inhibitor ALLN for 24 hours promoted the accumulation of SOD-1 A4V YFP aggregates in HEK-293 cells but not in SOD-1 Wild Type YFP transduced cells. Furthermore, there were very low levels of aggregation in U2 OS and SH-SY5Y cell lines SOD-1 A4V YFP transduced with the same vectors. After seeding the cells in the presence or absence of ALLN, they were monitored for aggregate formation for a period of 50 hours.ALLN aggregate formation reached a plateau at 24 hours and remained stable over the next 12 hours. Furthermore, cell density significantly decreased after 28 hours as a result of the cytotoxic effect of ALLN, while cell number increased in the DMSO-treated negative control. SOD-1 A4V YFP cells cultured in the presence of proteasome inhibitors for 24 hours were stained with Hoechst solution.The relative toxicity for three different proteasome inhibitors was quatified by measuring the number of adherent cell lines remaining in the well labeled with Hoechst dye. The total cell number decreased in response to increased dose of protease inhibitors. Inversely, the percentage of cells expressing SOD-1 A4V aggregates increased with the concentration of protease inhibitor.When doing this process it is important to remember that the cell quality will drastically influence your result. So it's important to determine that the cells are microplasma free and are healthy all along the steps. Following this process, another imaging method can be used in order to answer additional questions regarding the degradation of protein or the interaction of the protein with others using resonance energy transfer.After watching this video, you should have a good understanding of how to generate the tools to test the fate of protein in multiple living cells using high-content image analysis. So this method can provide insight into protein aggregation as it occurs in simple cellular models. It can also be applied to other systems such as neuron differentiated from patient specific induced pluripotent stem cells.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...