Name: a convenient method for extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography of catecholamine neurotransmitters and their metabolites
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00
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这项研究得到了中国国家科学基金会 (81172720, 81673230 号) 的支持, 江苏省科技部社会发展研究项目 (no。BE2016741), 中国质量监督检验检疫总局科学 & 技术项目 (2015QK055), 教育部儿童发展与学习科学重点实验室开放项目方案,东南大学 (CDLS-2016-04)。我们真诚地感谢元宋和萍柳协助我们收集样品。

获得了父母的知情同意, 并获得了机构审查委员会的批准。这项研究是按照世界医学协会 (赫尔辛基宣言) 的道德准则进行的, 涉及人类的实验。所有参与者的照顾者都提供了书面同意, 让他们参加这项研究。还获得了东南大学附属中大医院的伦理委员会批准。
1. 为提取和测定儿茶酚胺所需的柱和溶液的制备
<ol><li>准备 PFSPE 列。将1-2 毫克的四氯乙烯-PS 纳米纤维分成5-6 整除数,...

本文提出的 PFSPE 方法在快速、简便、方便等方面具有重要意义。该协议中所用的吸附剂是静电纺丝纳米纤维, 具有较高的表面面积到体积比, 并吸附的方法, 高效。该程序只需要几毫克的碳纤维和少量的淋洗剂组成溶剂, 不需要蒸发步骤集中的分析。在这里, 我们详细介绍了一种基于 HPLC-幼儿发展的协议, 这将允许新用户建立有效的方法来检测和量化三儿茶酚胺及其两个代谢产物 (NE, E, DA 和 MHPG, DOPAC...

儿茶酚胺类神经递质及其代谢物在体液中的含量可以影响神经功能, 并在很大程度上影响反应刺激状态的平衡1。异常可能导致多种疾病, 如 pheochromacytoma、肾上腺、神经母细胞瘤和神经系统疾病1,2。体液中儿茶酚胺的提取和测定对相关疾病的诊断有重要意义。然而, 生物样品中的儿茶酚胺存在于低浓度, 易于氧化。此外, 由于介质3中的大量干扰, 它们很难洗脱。因此, 同时检测生物液中的儿茶酚胺仍然是一个挑战。
有评论表明, 尿儿茶酚胺可以是一种压力的量度, 他们的水平是重要的生物标记反应的触觉刺激处理新生儿5。根据这项研究, 所有患有过早事件的婴儿都有患脑损伤的风险4,5,6, 伤害可能导致儿茶酚胺的异常释放和相关物质进入体液。在早期的阶段7,8中, 存在能够检测大脑损伤的先进磁共振技术。然而, 在前48小时内, 异常神经发育过程将导致永久性脑损伤, 这在医学图像11中是不明显的。此外, 高昂的成本和稀缺的仪器资源, 连同其他因素, 使得所有新生单位都无法获得这些专门的神经成像技术。然而, 使用易于接近和实用的生物标志物 (如儿茶酚胺及其代谢物) 可以克服这些缺点, 并筛选人体体液中的生物标记可能有助于早期诊断脑损伤, 并导致提示新生儿需要神经保护的识别9。尿中的儿茶酚胺可以是一个容易和明显的指标, 因为它的数量之间的直接关系释放到液体和 neuroactivity 功能。
在生物体液中, 脑脊液 (CSF) 和血浆样本不易通过现有的创伤程序, 而且由于粘附蛋白和其他杂质也很难消除干扰, 导致了麻烦和耗时的取样过程不适合重复检测。此外, 对于儿童来说, 很难以创伤的方式获取样本。因此, 尿液取样优于其他形式的取样, 因为它是无创、易操作的, 可以反复进行。尿样丰富, 易于贮存, 比其他生物样品具有更大的优越性。
定量测定生物液中儿茶酚胺的主要方法包括 radioenzymic 化验10、酶联免疫吸附剂化验11、伏安12和热透镜光谱分析13。但存在着复杂的操作和难以检测的多目标等缺点。目前, 主要的分析技术是高效液相色谱 (HPLC)14, 加上敏感的电化学15或荧光检测16, 因为其灵敏度高, 选择性好。采用串联质谱技术, 如液相色谱/质谱 (lc/ms) 和液相色谱/质谱/质谱 (lc/ms), 分析和定量的神经递质可以达到高准确性和特异性17,18。然而, MS 技术需要昂贵的仪器和大量的合格的人力, 使这一方法难以普遍适用于大多数传统实验室。高效液相色谱-幼儿早期系统在大多数常规和临床实验室中都有广泛的应用, 因此成为研究小组用于化学测定的一个普遍而又好的选择, 但它们要求将样品引入系统中进行清洁和微型卷19。因此, 在分析之前, 对样品进行提纯和浓缩是非常重要的。纯化步骤的经典方法是液-液萃取14,15,20和离线固相萃取, 包括活化氧化铝柱21,22和 diphenylborate (DPBA) 络合23,24,25,26。
Myeongho 李等。已使用以冠醚化学修饰的高分子树脂作为吸附剂, 自 2007年27以来选择性地从人尿中提取儿茶酚胺。此外, 在 2006年, 海博他et al。演示了一种简便的合成方法, boronate 亲和萃取吸附剂利用 functionalizable 纳米磁性面体寡聚 silsesquioxane (POSS) 的合成, 并将其应用于富集的儿茶酚胺人尿 (去甲肾上腺素, 肾上腺素和肾上腺素)28。他们也利用纳米材料来完成这项工作, 使用一种叫做纳米静电纺丝技术, 在纳米尺度上形成聚合物纤维材料。静电纺丝工艺可以通过控制工作电压和改变纺丝溶液的含量以及其他参数29来调整产品的直径、形貌和空间对准。与传统的 SPE 碳粉相比, 静电纺丝纳米纤维非常适合从复杂基质中提取和丰富目标分析物, 因为它们具有较高的表面积-体积比, 能有效吸附高效的分析分析,展示更易于控制的表面化学性质, 允许方便地附着的目标化合物。这些特性使它们成为 SPE 吸附剂的好选择, 大大减少了固相和解吸溶剂量30,31,32,33。对于尿样中的儿茶酚胺, 采用 apolymeric 冠醚与聚苯乙烯 (四氯乙烯-PS) 组成的静电纺丝纳米纤维, 选择性提取三儿茶酚胺 (NE, E, DA) 34.研究表明, 选择性冠醚吸附了 NE、E、DA 等靶点, 其基础是通过形成氢键来结合儿茶酚胺的正确几何。该结果有效地显示了材料冠醚, 去除了生物样品中含有的其它干扰化合物。通过本报告的启发, 提出了一种新的方法, 用于选择性提取儿茶酚胺的静电纺丝复合纳米纤维组成的四氯乙烯-PS。
本文对以前的34方法进行了改进和应用, 不仅成功地分析了 E、NE 和 DA, 而且在尿液中还有其代谢物、MHPG 和 DOPAC。我们还探讨了吸附过程机理的新可能性。该方法对五种分析物的提取效率和选择性有满意的效果, 并对围产期脑损伤和健康控制的高危儿尿液的检测进行了验证。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>column to contain nanofibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCE-PS nanofibers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>material for PFSPE extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel rod (about 0.5 mm diameter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fill the nanofibres into the column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gastight plastic syringe (5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>compress solution into the end of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>A-106408</td>
			<td>complex reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>norepinephrine(NE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>A-9512</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>H1377</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine(E)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>100154-200503</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>D-9128</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dopamine(DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>H-8502</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>858781</td>
			<td>interior label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>eluriant and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7664-38-2</td>
			<td>eluriant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>69-93-2</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>creatinine</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>60-27-5</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>SWC0140326</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2Na2O4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>62-76-0</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10039-32-4</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>77-92-9</td>
			<td>artifical urine and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>34124-14-6</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monometallic sodium orthophosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>artifical urine and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-heptanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>22767-50-6</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylboronic acid column(PBA column)</td>
			<td>Aglilent</td>
			<td>12102018</td>
			<td>PBA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inertsil&#174; ODS-3 5 &#181;m 4.6&#215;150 mm column</td>
			<td>Dikma</td>
			<td>5020-06731</td>
			<td>HPLC column for seperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>SIL-20AC</td>
			<td>auto injection for eluriant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>LC-20AD</td>
			<td>HPLC pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>L-ECD-60A</td>
			<td>detector for the analytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System</td>
			<td>Micromeritics, USA</td>
			<td></td>
			<td>surface and porosity analyzer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a convenient method for extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography of catecholamine neurotransmitters and their metabolites

生物液中儿茶酚胺类神经递质的提取和分析对评价神经系统功能和相关疾病具有重要意义, 但其精确测量仍然是一个挑战。许多协议已被描述为神经递质测量的各种仪器, 包括高压液相色谱 (HPLC)。然而, 存在着复杂的操作或难以检测的多目标的缺陷, 但目前仍存在着以高效液相色谱和敏感电化学或荧光检测为主导的分析技术, 由于灵敏度高, 选择性好。本文介绍了用静电纺丝复合纳米纤维组成的高压力液相色谱法在婴幼儿真实尿样中对儿茶酚胺的预处理和检测的详细协议。以聚苯乙烯为吸附剂的高分子冠醚, 也称为填料-纤维固相萃取 (PFSPE) 法。我们展示了如何容易 precleaned 尿样的碳纤维包装固体相柱, 以及如何在样品中的分析物可以迅速丰富, 吸, 并发现在一个幼儿系统。PFSPE 大大简化了生物样品的预处理程序, 从而减少了时间、费用和减少目标损失。
总的来说, 这项工作说明了一个简单和方便的协议, 固相萃取耦合的 HPLC-幼儿系统, 同时测定三单胺类神经递质 (NE), 肾上腺素 (E), 多巴胺 (DA)) 和两个其代谢产物 (3-甲氧基 4 hydroxyphenylglycol (MHPG) 和 34-二羟基苯乙酸 (DOPAC)) 在婴幼儿尿液中。建立的协议用于评估高危婴儿与围产期脑损伤和健康控制之间的尿儿茶酚胺及其代谢物的差异。比较分析发现两组尿 MHPG 有显著差异, 表明儿茶酚胺代谢物可能是早期诊断婴幼儿脑损伤危险病例的重要候选指标。

该协议是一种简便、方便的 PFSPE 方法, 预处理尿样, 通过高效液相色谱-幼儿系统丰富五儿茶酚胺进行检测;进程的图表显示在图 1中。该协议主要包括四步激活, 加载, 冲洗和洗脱-结合少量的四氯乙烯-PS 纳米纤维和一个简单的固相萃取装置。用表面和孔隙度分析仪对四氯乙烯-PS 纳米纤维的形貌进行了评估 (见材料表)。纹理属性-赌注 (布鲁?...

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A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

我们提出了一种方便的固相萃取与高压液相色谱 (HPLC) 结合电化学检测 (幼儿发展) 同时测定三单胺类神经递质和两个代谢物在婴儿的尿液中。我们还确定代谢物 MHPG 作为早期诊断婴儿脑损伤的潜在生物标志物。

用高压液相色谱法提取和分析儿茶酚胺神经递质及其代谢物的简便方法

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

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