Name: a convenient method for extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography of catecholamine neurotransmitters and their metabolites
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por la nacional ciencia Fundación de China (No.81172720, Nº 81673230), el Departamento de tecnología (Nº y Social desarrollo investigación programa de Jiangsu provincia de ciencia BE2016741), ciencia y tecnología de China la Administración General de supervisión de calidad, inspección y cuarentena (2015QK055), el programa del proyecto abierto del laboratorio clave de ciencia del Ministerio de educación, de aprendizaje y desarrollo del niño Universidad del sureste (CDL-2016-04). Reconocemos sinceramente Song Yuan y Ping Liu que nos ayudaron en la recogida de muestras.

Se obtuvo consentimiento informado de los padres, y se obtuvo la aprobación de la Junta de revisión institucional para el estudio. El estudio se realizó según el código de ética de la Asociación Médica Mundial (declaración de Helsinki) para experimentos con seres humanos. Cuidadores de todos los participantes siempre consentimiento para ser incluidos en el estudio. Aprobación del Comité ético del Hospital Zhongda, afiliado con la Universidad del sureste, también se obtuvo.
1. prepar...

El método PFSPE propuesto en este documento puede ser significativa y significativa con respecto a su rapidez, sencillez y comodidad. Los adsorbentes utilizados en el protocolo son nanofibras electrospun, que tienen una proporción de volumen de área de superficie alta y por la adsorción de los analitos con alta eficiencia. El procedimiento sólo necesita unos pocos miligramos de nanofibras y un pequeño volumen de disolvente eluant y no requiere un paso de evaporación para concentrar los analitos. Aquí, hemos prese...

Neurotransmisores de catecolamina y su contenido de metabolitos en los fluidos corporales puede afectan la función neuronal y afectar el equilibrio de los Estados de la respuesta a estímulo a una gran parte1. Anomalías que puede causar una variedad de enfermedades, tales como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma y trastornos neurológicos1,2. La extracción y la determinación de catecolaminas en fluidos corporales es significativo para el diagnóstico de las enfermedades relevantes. Sin embargo, las catecolaminas en muestras biológicas existen en bajas concentraciones y se oxidan fácilmente. Además, son muy difíciles a fin de eluir debido a la gran cantidad de interferencias en el medio3. Por lo tanto, la detección simultánea de catecolaminas en fluidos biológicos es todavía un reto.
Ha habido comentarios demostrando que Catecolaminas urinarias pueden ser una medida de la tensión, y que sus niveles son importantes marcadores biológicos en respuesta a la estimulación táctil en los recién nacidos5. Según la investigación, todos los niños que han sufrido incidentes prematuros están en riesgo de cerebro lesión4,5,6, y lesión puede causar la liberación anormal de catecolaminas y asuntos relacionados a los fluidos. Existen técnicas avanzadas de resonancia magnética que pueden detectar daño cerebral en anteriores fases7,8. Sin embargo, en las primeras 48 h, un proceso de desarrollo neurológico anormal causará lesión cerebral permanente que no será evidente en imágenes médicas11. Además, los recursos de alto costo y escaso instrumento, junto con otros factores, hace imposible para todas las unidades neonatales tener acceso a estas técnicas de neuroimagen especializadas. Sin embargo, el uso de un biomarcador fácilmente accesible y práctico (como las catecolaminas y sus metabolitos) puede superar estas deficiencias, y la proyección de un biomarcador en los fluidos humanos puede ayudar en el diagnóstico precoz de la lesión cerebral y conducir a identificación de los bebés recién nacidos que necesitan neuroprotección9. Las catecolaminas en la orina pueden ser un índice fácil y obvio, debido a la correlación directa entre la cantidad de ellos liberados en líquidos y la función de neuroactivity.
Entre los fluidos biológicos, muestras de plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) no son fáciles de conseguir a través de los procedimientos traumáticos, y también es muy difícil deshacerse de interferencia debido a la proteína adhesiva y otras impurezas, conduciendo a una problemática y proceso desperdiciador de tiempo de muestreo que es inadecuado para la detección repetida. También, para los niños, es casi imposible obtener las muestras de manera traumática. Por lo tanto, muestra urinaria es mejor que las otras formas de muestreo, ya que es no invasivo, fácil de manejar y puede hacerse varias veces. Las muestras de orina son abundantes y fáciles de almacenar y mostrar grandes ventajas sobre las otras formas de muestras biológicas.
Los métodos principales para cuantificar las catecolaminas en fluidos biológicos son radioenzymic ensayos10, ensayos inmune absorbente ligado a enzima11, voltametría12 y lente termal espectrometría13. Pero existen deficiencias, tales como operaciones complicadas y difíciles de detectar múltiples objetivos. Hoy en día, la técnica de análisis dominante es cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)14, juntada con sensibles electroquímico15 o fluorimétrica detección16, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Con la tecnología de espectrometría de masas tándem, como la cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) y cromatografía de líquidos/masas espectrometría/espectrometría de masas (LC/MS/MS), el análisis y cuantificación de los neurotransmisores pueden alcanzar altos exactitud y especificidad17,18. Sin embargo, la técnica MS requiere costosa instrumentación así como mano de obra calificada considerablemente, dificultando el método a aplicarse universalmente en los laboratorios más convencionales. Sistemas de HPLC-ECD se equipan comúnmente en laboratorios clínicos y más convencionales y así se han convertido en una común y buena opción para grupos de investigación a utilizar para la determinación química, pero requieren la muestra introducida en el sistema de limpia y de microescala volumen19. Por lo tanto, es de gran importancia para purificar y condensar la muestra antes del análisis. El método clásico para el paso de la purificación es la extracción líquido-líquido14,15,20 y extracción en fase sólida off-line, incluyendo columna de alúmina activada21,22 y diphenylborate (DPBA) complejación23,24,25,26.
Myeongho Lee et al. han estado utilizando resina de polímero modificada químicamente con éter de corona como adsorbente para extraer selectivamente las catecolaminas de la orina humana desde 200727. También, en 2006, Haibo He et al. demostró un enfoque de síntesis fácil de boronate afinidad extracción solvente byutilizing un compuesto de base nanomagnetic nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricos poliédricos (POSS) y aplicarlo en el enriquecimiento de catecolaminas en orina humana (noradrenalina y epinefrina, isoprenalina)28. También se aprovechó de los nanomateriales para cumplir con el trabajo, utilizando una tecnología llamada nano-electrospinning y formando el material fibroso del polímero en la nanoescala. El proceso de centrifugado eléctrico puede ajustar el diámetro, morfología y alineación espacial del producto controlando la tensión de trabajo y cambiar el contenido de la solución de hilatura junto con otros parámetros29. En comparación con el cartucho SPE convencional, nanofibras electrospun son altamente convenientes extraer y enriquecer analitos de una matriz compleja, ya que cuentan con alta relación superficie-área-volumen para los analitos con alta eficiencia, y exhiben más fácilmente controlado superficie propiedades químicas, permitiendo que el práctico accesorio de los compuestos objetivo. Estas propiedades hacen buenas opciones para adsorbentes SPE, reducción de la fase sólida y la desorción de solvente cantidad30,31,32,33. De catecolaminas en orina, nanofibras electrospun compuestos de éter de corona apolymeric con poliestireno (PCE-PS) se utilizan para extraer selectivamente tres catecolaminas (NE, E y DA)34. El documento indica que el éter corona selectivo adsorbe los objetivos de la NE, E y DA, que se basó en su geometría correcta para atar las catecolaminas a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Los resultados muestran el material éter corona eficazmente, eliminar otros compuestos interferentes en las muestras biológicas. Inspirado en este informe, un nuevo método fue desarrollado para la extracción selectiva de las catecolaminas por uso de nanofibras compuesto electrospun compuesto por PCE-PS.
En este trabajo, el método divulgado previamente34 fue mejorado y se emplea no sólo para analizar con éxito E, NE y DA, sino también sus metabolitos, MHPG y DOPAC, en orina. También exploramos nuevas posibilidades para el mecanismo del proceso de adsorción. El método muestra satisfactoria eficiencia de extracción y selectividad para los cinco analitos, y el método se verificó en el análisis de orina de bebés en alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>column to contain nanofibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCE-PS nanofibers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>material for PFSPE extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel rod (about 0.5 mm diameter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fill the nanofibres into the column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gastight plastic syringe (5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>compress solution into the end of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>A-106408</td>
			<td>complex reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>norepinephrine(NE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>A-9512</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>H1377</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine(E)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>100154-200503</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>D-9128</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dopamine(DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>H-8502</td>
			<td>analyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>858781</td>
			<td>interior label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich.Inc</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>eluriant and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7664-38-2</td>
			<td>eluriant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>69-93-2</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>creatinine</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>60-27-5</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>SWC0140326</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2Na2O4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>62-76-0</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10039-32-4</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>artifical urine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>77-92-9</td>
			<td>artifical urine and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>34124-14-6</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monometallic sodium orthophosphate</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>artifical urine and mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-heptanesulfonic acid sodium salt</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>22767-50-6</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylboronic acid column(PBA column)</td>
			<td>Aglilent</td>
			<td>12102018</td>
			<td>PBA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inertsil&#174; ODS-3 5 &#181;m 4.6&#215;150 mm column</td>
			<td>Dikma</td>
			<td>5020-06731</td>
			<td>HPLC column for seperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>SIL-20AC</td>
			<td>auto injection for eluriant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>LC-20AD</td>
			<td>HPLC pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector</td>
			<td>Shimadzu Corporation, Japan</td>
			<td>L-ECD-60A</td>
			<td>detector for the analytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System</td>
			<td>Micromeritics, USA</td>
			<td></td>
			<td>surface and porosity analyzer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a convenient method for extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography of catecholamine neurotransmitters and their metabolites

La extracción y análisis de los neurotransmisores catecolaminas en fluidos biológicos es de gran importancia en la evaluación de la función del sistema nervioso y las enfermedades, pero su medida exacta es todavía un reto. Muchos protocolos se han descrito para la medición de neurotransmisores por una variedad de instrumentos, incluyendo la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Sin embargo, existen deficiencias, tales como operación complicada o difícil de detectar múltiples objetivos, que no se puede evitar, y en la actualidad, la técnica de análisis dominante sigue siendo HPLC juntada con sensible electroquímica o fluorimétrica detección, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Aquí, se describe un protocolo detallado para el pretratamiento y la detección de catecolaminas con cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ECD) en muestras de orina real de neonatos, mediante electrospun nanofibras compuesto compuesto de éter de corona poliméricos con el poliestireno como adsorbente, también conocido como el método de extracción (PFSPE) de la fase sólida de fibra lleno. Mostramos cómo orina muestras pueden ser precleaned fácilmente por una columna de fase sólida llena de nanofibras, y cómo los analitos en la muestra pueden enriquecerse rápidamente, desorbida y detectado en un sistema ECD. PFSPE simplifica notablemente los procedimientos de pretratamiento para las muestras biológicas, lo que permite disminución de tiempo, costo y reducción de la pérdida de objetivos.
En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la extracción en fase sólida acoplada a un sistema de HPLC-ECD para determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) y dos de sus metabolitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) y ácido 3, 4-dihydroxy-fenilacético (DOPAC)) en la orina de los bebés. Se aplicó el protocolo establecido para evaluar las diferencias de catecolaminas urinarias y sus metabolitos entre neonatos de alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos. Análisis comparativo reveló una diferencia significativa de MHPG urinario entre los dos grupos, indicando que los metabolitos de catecolaminas pueden ser un marcador importante candidato para el diagnóstico precoz de casos en riesgo de daño cerebral en recién nacidos.

Este protocolo es un método simple y conveniente de PFSPE pretratar las muestras de orina y enriquecer las cinco catecolaminas para la detección mediante el sistema de HPLC-ECD; en la figura 1muestra un diagrama del proceso. El protocolo incluye principalmente cuatro pasos activación, carga, enjuague y liberador - junto con una pequeña cantidad de nanofibras PCE-PS y un dispositivo de extracción en fase sólida simple. La morfología de nanofibras PCE-PS...

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A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Research

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Chemistry

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