Name: measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells at JoVE.com

Ringraziamo Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs dalla divisione dell'Influenza del CDC per la loro revisione critica e assistenza nella preparazione di questo manoscritto. Si ringrazia il Dr. Adrian Reber dalla divisione dell'Influenza del CDC per la sua assistenza nel preparare la grafica della Figura 3. Infine, desideriamo ringraziare il Dr. M. Matrosovich, Marburg, in Germania, per fornire le cellule MDCK-SIAT1.

Tutti i virus influenzali devono essere gestiti secondo i requisiti del livello di biosicurezza appropriato (BSL-2 o superiore) come definito in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)12.

1. preparazione dei reagenti e materiale di partenza
<ol><li>
Preparare le cellule MDCK-SIAT1 e terreno di coltura sterile cellulare
	<ol>
<li>Preparare il terreno di coltura delle cellule MDCK-SIAT1 utilizzando 500 mL...

<ol>
	<li>Reber, A., Katz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+assessment+of+influenza+vaccines+and+immune+correlates+of+protection.">Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection.</a> Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).</li><li>Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+protection+against+influenza+infection+in+humans--on+the+path+to+a+universal+vaccine?.">Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine?.</a> Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).</li><li>WHO Global Influenza Surveillance Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).</li><li>Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+immunogenicity+of+influenza+viruses+cultivated+in+Vero+or+MDCK+cells+and+in+embryonated+chicken+eggs.">Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs.</a> Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+Antibody+Responses+to+Antigenically+Drifted+Influenza+A(H3N2)+Viruses+among+Children+and+Adolescents+following+2014-2015+Inactivated+and+Live+Attenuated+Influenza+Vaccination.">Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+characteristics+and+antigenic+properties+of+recently+emerged+subclade+3C.3a+and+3C.2a+human+influenza+A(H3N2)+viruses+passaged+in+MDCK+cells.">The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells.</a> Influenza Other Respir Viruses. , (2017).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment?.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?.</a> J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Skowronski, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+acquired+during+cell+culture+isolation+may+affect+antigenic+characterisation+of+influenza+A(H3N2)+clade+3C.2a+viruses.">Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses.</a> Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDCK-SIAT1+cells+show+improved+isolation+rates+for+recent+human+influenza+viruses+compared+to+conventional+MDCK+cells.">MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells.</a> J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).</li><li>US Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).</li><li>Reed, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> The American Journal of Hygiene. 27, (1938).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Laboratory+Comparison+of+Influenza+Microneutralization+Assays+for+A(H1N1)pdm09,+A(H3N2),+and+A(H5N1)+Influenza+Viruses+by+CONSISE.">International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE.</a> Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).</li><li>Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Quantitative+Micro-neutralization+Assay.">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2016).</li><li>van Baalen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViroSpot+microneutralization+assay+for+antigenic+characterization+of+human+influenza+viruses.">ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses.</a> Vaccine. 35, 46-52 (2017).</li></ol>

Il dosaggio di MN è uno dei principali saggi utilizzati per i test sierologici dell'influenza per rilevare le risposte di anticorpi dell'influenza infezione o la vaccinazione. I titoli generati da saggi di MN sono spesso utilizzati come il risultato primario di molti studi di seroepidemiology di riossidazione. MN saggi sono anche ampiamente utilizzati per la sero-diagnosi e la valutazione dell'immunogenicità del vaccino. Internazionali inter-laboratorio studi sono stati condotti per confrontare saggi MN eseguite in pi?...

Virus influenzali continuano a causare morbilità e mortalità nella popolazione umana ogni anno. HA è la glicoproteina di superficie principale di virus influenzali. Anticorpi neutralizzanti HA di targeting sono il principale meccanismo immune che correla con la protezione di infezione influenzale1,2. Emoagglutinazione inibizione (HI) saggi e saggi di MN sono due metodi ampiamente usati per misurare le risposte dell'anticorpo in sieri umani dopo di infezione o la vaccinazione influenzale3. Il test HI misura l'inibizione dell'anticorpo di emagglutinazione virus dei globuli rossi ed è considerato un saggio di surrogati. A differenza di HI, il dosaggio di MN può direttamente misurare i livelli di anticorpi nel siero umano che neutralizzano l'infezione di riossidazione in colture cellulari. Le cellule MDCK sono spesso utilizzate nell'isolamento del virus dell'influenza e MN saggi4.
Virus influenzali sono sottoposti costantemente deriva antigenica e MAIUSC, l'acquisizione di mutazioni HA proteine che possono alterare la specificità di legame del recettore del virus. Dal 2014, nuovi cluster di A(H3N2) virus è emerso e continuò a circolare fino alla stagione corrente. La maggior parte di questi virus appartenga al gruppo genetico 3C.2a e 3C.3a basato su analisi filogenetica delle proteine HA. Molti dei virus circolanti 3C.2a aveva ridotto la capacità di hemagglutinate globuli rossi e quindi non possono essere caratterizzati da HI saggi5. Saggi di neutralizzazione devono essere utilizzati per misurare le risposte dell'anticorpo a questi virus che non hemagglutinate6. Inoltre, gli studi hanno indicato che questi virus A(H3N2) contemporanei hanno alterato le proprietà di binding recettoriale rispetto ai precedenti A(H3N2) virus e tendono ad accumulare mutazioni cultura adattato e polimorfismo quando attraversate in vitro delle cellule culture7,8,9. Rispetto ai convenzionali cellule MDCK, MDCK-SIAT1 è una linea cellulare sviluppata da Matrosovich et al. mediante trasfezione stabile di cellule MDCK con cDNA di umano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Questa linea cellulare esprime gli importi aumentati di α2, moiety 6-sialico galattosio e quantità in diminuzione di α2, acido 3-sialico moiety rispetto al padre di cellule MDCK10. Le cellule MDCK-SIAT1 sono indicate per migliorare i tassi di isolamento per A(H3N2) virus rispetto alle cellule MDCK11. Recentemente, Lin et al. ha riferito che di recente è emerso 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) dell'influenza virus umani, più fedeli repliche di virus e meglio infettività del virus sono stati raggiunti quando virus sono stati coltivati in linee cellulari MDCK-SIAT1 rispetto a cellule MDCK7. Così, le cellule MDCK-SIAT1 sono più adatti in saggi di MN per caratterizzare le risposte dell'anticorpo ai recenti cluster di A(H3N2) virus.
Qui descriviamo un'analisi di MN usando cellule MDCK-SIAT1 per misurare le risposte dell'anticorpo a contemporanea 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) virus in sieri umani. Virus coltivato in uova o da cellule può essere usato per questo test. Sieri di calore inattivato contenente anticorpi neutralizzanti sono prima diluiti serialmente, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare al virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire il A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1 e replicare. Dopo l'incubazione durante la notte, le piastre sono fissate e la quantità di virus in ogni pozzetto è quantificata mediante un test ELISA che usando gli anticorpi monoclonali di anti-riossidazione A NP. La rilevazione di NP indica la presenza dell'infezione del virus e l'assenza di anticorpi neutralizzanti. Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">11965</td>
			<td style="width:308px;">A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:181px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">3117332001</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">25030-081</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td>11360-070</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Geneticin G-418 disulfate salt&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A1720-5G&#160;&#160;</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15630-080</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15140-122</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:295px;">Acetone</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">67-64-1</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 80% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBF2806V</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBQ1086V</td>
			<td style="width:308px;">1 tablet per 100ml of cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:295px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A510-P500</td>
			<td style="width:308px;">Used 0.5M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">Ethanol, Denatured, 4L</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">EM-AX0422-3</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 70% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">1748048</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RDE II &#34;Seiken&#34;</td>
			<td style="width:181px;">Denka Seiken</td>
			<td style="width:185px;">370013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tween 20</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1379-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-NP mouse monoclonal Ab</td>
			<td style="width:181px;">Millipore pool</td>
			<td style="width:185px;">MAB 8257 MAB 8258</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-mouse IgG HRP&#160;</td>
			<td style="width:181px;">KPL</td>
			<td style="width:185px;">074-1802</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">3455</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Plate reader</td>
			<td style="width:181px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:185px;">Spectromax 384 plus</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap</td>
			<td style="width:181px;">Corning/VWR</td>
			<td style="width:185px;">3151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells

Anticorpi neutralizzanti contro emoagglutinina (HA) di virus influenzali sono considerati il principale meccanismo immune che correla con protezione per infezioni influenzali. Saggi microneutralization (MN) sono spesso utilizzati per misurare le risposte anticorpali neutralizzanti nel siero umano dopo vaccinazione contro l'influenza o infezione. Cellule di rene canino Madine Darby (MDCK) sono il substrato di cella comunemente utilizzata per le analisi di MN. Tuttavia, l'influenza A(H3N2) 3C.2a e 3C.3a hanno acquisito il virus attualmente in circolazione alterata specificità di legame del recettore. La linea cellulare di MDCK-SIAT1 con moiety aumentata α-2,6 galattosio sialico sulla superficie ha dimostrato di fornire infettività migliorata e le repliche più fedeli rispetto alle cellule MDCK convenzionale per questi virus A(H3N2) contemporanei. Qui, descriviamo un saggio di MN usando le cellule MDCK-SIAT1 che è stato ottimizzato per quantificare i titoli dell'anticorpo neutralizzante a questi virus A(H3N2) contemporanei. In questo protocollo, calore inattivato sieri contenenti anticorpi neutralizzanti sono in primo luogo in serie diluiti, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare ai virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1. Dopo l'incubazione overnight, piastre sono fissi e la quantità di virus in ogni bene è quantificata mediante un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anti-influenzale un anticorpi monoclonali nucleoproteina (NP). Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

Determinazione di infettività delle scorte virus è il primo passo nell'analisi della MN. La figura 2 illustra il layout della piastra per determinare il TCID50 degli stock di virus. Per gli stock di virus con infettività sconosciuto, il virus può essere titolato da pre-diluizioni multiple, ad esempio 10-2 e 10-3, al fine di acquisire la migliore curva di titolazione per calcolare infettività del virus. La quantità di vir...

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Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticorpi neutralizzanti l'influenza correlano con protezione delle infezioni influenzali. Saggi microneutralization misurano anticorpi neutralizzanti nel siero umano e sono spesso utilizzati per sierologia umana dell'influenza. Descriviamo un dosaggio di microneutralization usando le cellule MDCK-SIAT1 per misurare i titoli dell'anticorpo neutralizzante ai virus contemporaneo di A(H3N2) di 3C.2a e 3C.3a dopo la vaccinazione contro l'influenza o infezione.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

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