Name: measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells at JoVE.com

この原稿の準備で博士 Xiuhua Lu、リュー風水とその批判的検討と支援の CDC のインフルエンザ部門からさんアシュリー ・ バロウズに感謝します図 3のグラフィックスを準備することの彼の援助の CDC のインフルエンザ部門から博士エイドリアン ・ レーバーに感謝いたします。最後に、博士 M. Matrosovich、マールブルク、ドイツ SIAT1 MDCK 細胞を提供するために感謝いたします。

すべてのインフルエンザ ウイルスは、適切なバイオ セーフティ レベル要件に従って処理する必要があります (BSL 2 またはそれ以上) の微生物学的および生物医学研究所 (BMBL)12バイオで定義されています。

1. 試薬・原料の準備
<ol><li>
SIAT1 MDCK 細胞と無菌細胞培養培地を準備します。
	<ol>
<li>高グルコースと 500 mL ダルベッコ変更イーグ...

<ol>
	<li>Reber, A., Katz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+assessment+of+influenza+vaccines+and+immune+correlates+of+protection.">Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection.</a> Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).</li><li>Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+protection+against+influenza+infection+in+humans--on+the+path+to+a+universal+vaccine?.">Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine?.</a> Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).</li><li>WHO Global Influenza Surveillance Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).</li><li>Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+immunogenicity+of+influenza+viruses+cultivated+in+Vero+or+MDCK+cells+and+in+embryonated+chicken+eggs.">Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs.</a> Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+Antibody+Responses+to+Antigenically+Drifted+Influenza+A(H3N2)+Viruses+among+Children+and+Adolescents+following+2014-2015+Inactivated+and+Live+Attenuated+Influenza+Vaccination.">Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+characteristics+and+antigenic+properties+of+recently+emerged+subclade+3C.3a+and+3C.2a+human+influenza+A(H3N2)+viruses+passaged+in+MDCK+cells.">The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells.</a> Influenza Other Respir Viruses. , (2017).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment?.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?.</a> J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Skowronski, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+acquired+during+cell+culture+isolation+may+affect+antigenic+characterisation+of+influenza+A(H3N2)+clade+3C.2a+viruses.">Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses.</a> Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDCK-SIAT1+cells+show+improved+isolation+rates+for+recent+human+influenza+viruses+compared+to+conventional+MDCK+cells.">MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells.</a> J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).</li><li>US Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).</li><li>Reed, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> The American Journal of Hygiene. 27, (1938).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Laboratory+Comparison+of+Influenza+Microneutralization+Assays+for+A(H1N1)pdm09,+A(H3N2),+and+A(H5N1)+Influenza+Viruses+by+CONSISE.">International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE.</a> Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).</li><li>Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Quantitative+Micro-neutralization+Assay.">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2016).</li><li>van Baalen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViroSpot+microneutralization+assay+for+antigenic+characterization+of+human+influenza+viruses.">ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses.</a> Vaccine. 35, 46-52 (2017).</li></ol>

MN アッセイは、インフルエンザ血清インフルエンザ感染またはワクチン接種後抗体を検出するために使用する主な試金のひとつです。ミネソタの試金から生成された抗体は多くのインフルエンザおこなえる研究の主な成果として使われます。ミネソタの試金は、血清診断とワクチンの免疫原性の評価にも広く使用されます。MN アッセイ複数研究所14の実行を比較する国際間?...

インフルエンザ ウイルスは、人間の人口毎年の罹患率と死亡率を引き起こし続けます。HA は、インフルエンザ ウイルスの主要な表面の糖蛋白。HA を対象と中和抗体は、インフルエンザ感染1,2の保護に関係する主な免疫メカニズムです。赤血球凝集抑制 (HI) アッセイ MN アッセイは、インフルエンザ感染症や予防接種3後血清抗体を測定に広く用いられる 2 つの方法。こんにちはアッセイは赤血球凝集抑制抗体を測定し、サロゲートの試金であります。こんにちとは異なり MN の試金は直接細胞培養のインフルエンザ感染を中和するヒトの血清中の抗体のレベルを測定できます。MDCK 細胞、インフルエンザ ウイルス分離に使われます、MN4の試金。
インフルエンザ ウイルスは、抗原ドリフトとウイルスの受容体結合特異性を変えることができる HA 蛋白の変異を取得し、shift キーを常に受けます。2014 年以来 a (h3n2) ウイルスの新しいクラスターが登場し、現在のシーズンまで循環し続けた。これらのウイルスのほとんどは、遺伝的グループ 3C.2a と HA タンパク質の系統解析に基づく 3C.3a に属します。循環の 3C.2a ウイルスの多くは赤血球を hemagglutinate する能力を減少していた、こんにちは試金5特徴ことはできません。中和の試金は6を hemagglutinate いないこれらのウイルスの抗体を測定するために使わなければなりません。また、研究によるとこれら現代の a (h3n2) ウイルスが以前 a (h3n2) のウイルスと比較して受容体結合特性を変更しているし、文化適応変異と多型生体外細胞で継代されたときに蓄積する傾向があります。文化7,8,9。従来の MDCK 細胞と比べて、MDCK SIAT1 は Matrosovichらによって開発された細胞株です。を通じて人間 α 2, 6-sialtransferase (SIAT1) の cDNA を用いた MDCK 細胞のトランスフェクションを安定。この細胞株は、α 2, 6 シアル ガラクトースと親 MDCK 細胞10より 3 シアル酸部分の α 2、量も減るの増加量を表しています。SIAT1 MDCK 細胞は MDCK 細胞11と比較して a (h3n2) ウイルスの分離率を改善するために示されています。最近では、林ら新たに出現した 3C.2a および 3C.3a 人間 a (h3n2) インフルエンザ ウイルスのより忠実なウイルス複製よりウイルス感染であったウイルスが MDCK 細胞7と比較して SIAT1 MDCK 細胞の培養が報告。したがって、a (h3n2) ウイルスの最近のクラスター抗体反応を特徴付けるミネソタの試金は SIAT1 MDCK 細胞が適しています。
ここ現代 3C.2a とひと血清中の 3C.3a a (h3n2) ウイルスに抗体を測定する SIAT1 MDCK 細胞を用いた MN の試金を記述します。卵の細胞成長のウイルスは、この試金で使用できます。熱不活化血清中和抗体を含むは希釈した直列ではまず、100 TCID50/インフルエンザ a (h3n2) ウイルスにバインドする血清中の抗体を許可するのも、培養しました。SIAT1 MDCK 細胞はウイルス抗体の混合物に追加し、37 ° c、a (h3n2) ウイルス SIAT1 MDCK 細胞に感染し、複製を許可する 5% CO2 18 20 時間培養します。一晩インキュベートした後、プレート固定、抗インフルエンザ A NP モノクローナル抗体を用いた elisa 法による各ウェルのウイルスの量を定量化します。NP の検出は、ウイルス感染の有無と中和抗体の有無を示します。中和抗体は、ウイルスの感染性の ≥ 50% 阻害を提供します最高血清希釈の逆数として定義されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">11965</td>
			<td style="width:308px;">A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:181px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">3117332001</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">25030-081</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td>11360-070</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Geneticin G-418 disulfate salt&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A1720-5G&#160;&#160;</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15630-080</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15140-122</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:295px;">Acetone</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">67-64-1</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 80% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBF2806V</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBQ1086V</td>
			<td style="width:308px;">1 tablet per 100ml of cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:295px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A510-P500</td>
			<td style="width:308px;">Used 0.5M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">Ethanol, Denatured, 4L</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">EM-AX0422-3</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 70% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">1748048</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RDE II &#34;Seiken&#34;</td>
			<td style="width:181px;">Denka Seiken</td>
			<td style="width:185px;">370013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tween 20</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1379-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-NP mouse monoclonal Ab</td>
			<td style="width:181px;">Millipore pool</td>
			<td style="width:185px;">MAB 8257 MAB 8258</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-mouse IgG HRP&#160;</td>
			<td style="width:181px;">KPL</td>
			<td style="width:185px;">074-1802</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">3455</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Plate reader</td>
			<td style="width:181px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:185px;">Spectromax 384 plus</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap</td>
			<td style="width:181px;">Corning/VWR</td>
			<td style="width:185px;">3151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン (HA) に対する中和抗体は、インフルエンザ感染症のための保護に関係する主な免疫機構と見なされます。中和 (MN) の試金はインフルエンザ予防接種や感染症後ひと血清中の中和抗体を測定するために使われます。Madine ダービー犬腎臓 (MDCK) 細胞は、MN の試金のための一般的に使用されるセル基板です。しかし、受容体結合特異性を変更現在循環 3C.2a と 3C.3a の a (h3n2) インフルエンザ ウイルスが取得しています。表面に増加 α 2, 6 シアル ガラクトース防 MDCK SIAT1 細胞株は、これら現代の a (h3n2) ウイルスの改良された感染性と従来の MDCK 細胞よりもより忠実な複製を提供するために証明されています。ここでは、これら現代の a (h3n2) ウイルス中和抗体を定量化するために最適化された SIAT1 MDCK 細胞を用いた MN アッセイについて述べる。このプロトコルでは熱不活化血清中和抗体を含む最初連続希釈されて、次いで, 100 TCID50/インフルエンザ a (h3n2) ウイルスにバインドする血清中の抗体をできるようにするのも。SIAT1 MDCK 細胞はウイルス抗体の混合物に追加し、37 ° c、a (h3n2) ウイルス SIAT1 MDCK 細胞に感染するを許可するように 5% CO2 18 20 時間培養します。一晩インキュベートした後板が固定されており、それぞれのウイルスの量も抗インフルエンザ ウイルスを用いた酵素免疫測定法 (ELISA) による定量化は np モノクローナル抗体。中和抗体は、ウイルスの感染性の: 50% 阻害を提供します最高血清希釈の逆数として定義されます。

ウイルス株の感染性の決定は、MN の試金の最初のステップです。図 2は、ウイルス株の TCID50を決定するプレート レイアウトを示しています。不明な感染力を持つウイルス株ウイルス ウイルスの感染性を計算する最高の滴定曲線をキャプチャするためにから複数の前希釈、たとえば 10-2と 10-3、滴定することができます。?...

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Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

インフルエンザ中和抗体は、インフルエンザ感染症の保護と関連付けてください。中和血清中和抗体価の測定し、インフルエンザのひと血清にしばしば使用します。次のインフルエンザの予防接種や感染症現代 3C.2a 3C.3a a (h3n2) ウイルス中和抗体価を測定する SIAT1 MDCK 細胞を用いた中和試験について述べる。

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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