Name: measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs da divisão da gripe do CDC para sua revisão crítica e assistência na preparação deste manuscrito. Agradecemos o Dr. Adrian Reber da divisão da gripe do CDC por sua assistência na preparação os gráficos da Figura 3. Por último, agradecemos o Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha para fornecer as células MDCK-SIAT1.

Todos os vírus da gripe devem ser tratados de acordo com requisitos de nível de biossegurança adequado (BSL-2 ou superior) como definido na Biossegurança na microbiológicas e Biomedical Laboratories (BMBL)12.

1. preparação dos reagentes e matérias-primas
<ol><li>
Preparar células MDCK-SIAT1 e meio de cultura celular estéril
	<ol>
<li>Preparar o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando de Dulbecco modificado águ...

<ol>
	<li>Reber, A., Katz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+assessment+of+influenza+vaccines+and+immune+correlates+of+protection.">Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection.</a> Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).</li><li>Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment?.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?.</a> J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Skowronski, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+acquired+during+cell+culture+isolation+may+affect+antigenic+characterisation+of+influenza+A(H3N2)+clade+3C.2a+viruses.">Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses.</a> Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDCK-SIAT1+cells+show+improved+isolation+rates+for+recent+human+influenza+viruses+compared+to+conventional+MDCK+cells.">MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells.</a> J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).</li><li>US Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).</li><li>Reed, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> The American Journal of Hygiene. 27, (1938).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Laboratory+Comparison+of+Influenza+Microneutralization+Assays+for+A(H1N1)pdm09,+A(H3N2),+and+A(H5N1)+Influenza+Viruses+by+CONSISE.">International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE.</a> Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).</li><li>Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Quantitative+Micro-neutralization+Assay.">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2016).</li><li>van Baalen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViroSpot+microneutralization+assay+for+antigenic+characterization+of+human+influenza+viruses.">ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses.</a> Vaccine. 35, 46-52 (2017).</li></ol>

O ensaio de MN é um dos principais ensaios utilizados para sorologia de gripe para detectar respostas de anticorpos após a infecção da gripe ou vacinação. Títulos gerados a partir de ensaios de MN são usados frequentemente como o resultado primário de muitos estudos de gripe hematológicas. Ensaios de MN são também amplamente utilizados para sero-diagnóstico e avaliação da imunogenicidade da vacina. Internacionais interlaboratório estudos têm sido realizados para comparar os ensaios de MN, realizados em v...

Vírus da gripe continuam a causar morbidade e mortalidade na população humana, a cada ano. HA é a glicoproteína de superfície principal de vírus da gripe. Anticorpos neutralizantes direcionamento HA são o principal mecanismo imune que se correlaciona com a proteção da gripe infecção1,2. Ensaios de inibição (HI) de hemaglutinação e ensaios de MN são dois métodos amplamente utilizados para medir respostas de anticorpos no soro humano após gripe infecção ou vacinação3. O ensaio de HI mede anticorpo da inibição da hemaglutinação vírus das células vermelhas do sangue e é considerado um ensaio de substituto. Ao contrário de HI, o ensaio de MN diretamente pode medir os níveis de anticorpos no soro humano que neutraliza a infecção da gripe em culturas de células. Células MDCK são frequentemente usadas no isolamento do vírus da gripe e MN ensaios4.
Vírus da gripe sofrem constantemente deriva antigênica e shift, adquirindo mutações em proteínas HA que podem alterar a especificidade de ligação do receptor do vírus. Desde 2014, novos grupos de A(H3N2) vírus emergiram e continuaram a circular até a temporada atual. A maioria destes vírus pertence ao grupo genético 3C.2a e 3C.3a com base na análise filogenética das proteínas HA. Muitos dos vírus circulantes 3C.2a tinham reduzido a capacidade de hemagglutinate células vermelhas do sangue e, portanto, não podem ser caracterizados por HI ensaios5. Ensaios de neutralização devem ser usados para medir as respostas de anticorpos para esses vírus que não hemagglutinate6. Além disso, estudos têm mostrado que estes vírus A(H3N2) contemporâneas alteraram as propriedades de ligação de receptores em comparação com anteriores A(H3N2) vírus e tendem a se acumular mutações cultura adaptada e polimorfismo quando passadas na cela em vitro culturas de8,7,9. Em comparação com células MDCK convencionais, MDCK-SIAT1 é uma linha de celular desenvolvida por Matrosovich et al . através do transfection estável de células MDCK com cDNA de α2 humano, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta linha de célula expressa uma quantidade aumentada de α2, metades 6-siálico galactose e diminuição da quantidade de α2, partes de ácido siálico-3 do que o pai de células MDCK10. Células MDCK-SIAT1 mostraram-se para melhorar as taxas de isolamento de vírus A(H3N2) em relação ao de células MDCK11. Recentemente, Lin et al. relatou-se que para o novo 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe vírus humanos, replicações de vírus mais fiel e melhor infecciosidade do vírus foram alcançados quando vírus eram cultivadas em linhas de células MDCK-SIAT1 comparadas com o de células MDCK7. Assim, as células MDCK-SIAT1 são mais adequadas em ensaios de MN para caracterizar respostas de anticorpos para os clusters recentes do vírus A(H3N2).
Aqui descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 para medir respostas de anticorpos para 3C.2a contemporânea e vírus A(H3N2) 3C.3a em soros humanos. Vírus cultivados em células ou ovos podem ser usados neste ensaio. Soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para ligar ao vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que o A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1 e replicar. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada poço é quantificada por um ELISA usando os anticorpos monoclonais antigripe A NP. A detecção de NP indica a presença de infecção pelo vírus e a ausência de anticorpos neutralizantes. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece a inibição de 50% ≥ de infecciosidade do vírus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">11965</td>
			<td style="width:308px;">A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:181px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">3117332001</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">25030-081</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td>11360-070</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Geneticin G-418 disulfate salt&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A1720-5G&#160;&#160;</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15630-080</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">15140-122</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:295px;">Acetone</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">67-64-1</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 80% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBF2806V</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">SLBQ1086V</td>
			<td style="width:308px;">1 tablet per 100ml of cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:295px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A510-P500</td>
			<td style="width:308px;">Used 0.5M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">Ethanol, Denatured, 4L</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:185px;">EM-AX0422-3</td>
			<td style="width:308px;">Used at an 70% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Life Science</td>
			<td style="width:185px;">1748048</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RDE II &#34;Seiken&#34;</td>
			<td style="width:181px;">Denka Seiken</td>
			<td style="width:185px;">370013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tween 20</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1379-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-NP mouse monoclonal Ab</td>
			<td style="width:181px;">Millipore pool</td>
			<td style="width:185px;">MAB 8257 MAB 8258</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Anti-mouse IgG HRP&#160;</td>
			<td style="width:181px;">KPL</td>
			<td style="width:185px;">074-1802</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">3455</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Plate reader</td>
			<td style="width:181px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:185px;">Spectromax 384 plus</td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap</td>
			<td style="width:181px;">Corning/VWR</td>
			<td style="width:185px;">3151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring influenza neutralizing antibody responses to a(h3n2) viruses in human sera by microneutralization assays using mdck-siat1 cells

Anticorpos neutralizantes contra a hemaglutinina (HA) de vírus da gripe são considerados o principal mecanismo imune que se correlaciona com proteção para infecções de gripe. Ensaios de Microneutralization (MN) são frequentemente usados para medir respostas de anticorpos neutralizantes em soros humanos após vacinação gripe ou infecção. Madine Darby Canine renal (MDCK) as células são o substrato de célula comumente utilizada para ensaios de MN. No entanto, atualmente circulam 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe adquiriram o vírus alterado especificidade de ligação do receptor. A linhagem de células MDCK-SIAT1 com metades de aumento α-2,6 siálico galactose na superfície provou para fornecer melhorada infecciosidade e replicações mais fiel do que células MDCK convencionais para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Aqui, descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 que foi otimizado para quantificar os anticorpos neutralizantes para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Neste protocolo, soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para vincular aos vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada bem é quantificada por um ensaio imunoenzimático (ELISA) usando antigripe uma cadeia (NP) os anticorpos monoclonais. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece ≥ 50% de inibição de infecciosidade do vírus.

Determinação da infectividade das populações de vírus é o primeiro passo no ensaio de MN. A Figura 2 ilustra o layout da placa para determinar a TCID50 das populações de vírus. Para reservas de vírus com infecciosidade desconhecida, o vírus pode ser titulado de várias pre-diluições, por exemplo 10-2 e 10-3, a fim de capturar a melhor curva de titulação para calcular a infectividade do vírus. A quantidade de v?...

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Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

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