Name: using the dot assay to analyze migration of cell sheets
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر بهاجاوات سوبرامانيان، تشانغ يي (جايسون)، بول Randazzo، والأصل كارول للقراءة والتعليق على هذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة".

1-طلاء أطباق (1 يوم)
ملاحظة: تأكد من عدم ترك بصمات الأصابع أو الاوساخ على الجزء السفلي من اللوحة عند التعامل مع الأمر.
<ol><li>ذوبان الجليد الماوس الكولاجين الرابع على الجليد، وتمييع مع 50 ملم HCl (pH 1.3) لإعداد 3 مل من 10 ميكروغرام/مل الكولاجين الحل الرابع. ملاحظة: سوف يعجل بالكولاجين عند 37 درجة ?...

<ol>
	<li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression.">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).</li><li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li><li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Bazelli&#232;res, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer.">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).</li><li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li><li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA,+HGF,+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells.">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501 (2013).</li><li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells.">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li><li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression.">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li><li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+over+long+time+scales+reveals+distinct+phenotypes.">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).</li><li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration.">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay.">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li><li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture.">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li></ol>

أثناء تطور الخلايا السرطانية يهاجر بعيداً عن الأنسجة الأصلية غزو الأنسجة المحيطة والسرطاني إلى مواقع بعيدة15. ويمكن ملاحظة هجرة خلايا بعيداً عن مستعمرة خلية في المقايسة دوت. ويتجلى المقايسة دوت هنا، تحليل النمط الظاهري المهاجرة من خلايا سرطان الثدي البشرية استجابة لمماثلة.</...

فحوصات الهجرة تستخدم على نطاق واسع لتقييم الإمكانات الغازية والمنتشر لورم الخلايا في المختبر. الأكثر شيوعاً، يستخدم بالجرح أو المقايسة الصفر لتقييم هجرة أوراق الظهارية في خلية بمسح منطقة1،2،3. لإجراء فحص الصفر، يتم مطلي الخلايا إلى أحادي الطبقة و "الصفر" أو منطقة خالية من خلية تم إنشاؤه باستخدام تلميح ماصة. مقايسة الصفر من السهل إعداد مع الإمدادات المتاحة عادة زراعة الأنسجة، ويمكن أن يؤديها في لوحات متعددة جيدا، مما يسمح لتجهيز عينات متعددة. ومع ذلك، كما هو الصفر، الخلايا يتم إزالتها فعلياً من أحادي الطبقة وغالباً الخضوع لموت الخلايا. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تلف المصفوفة خارج الخلية التي تعلق على اللوحة خلال عملية الخدش. وبالمثل، إدراج استخدام السليكون (مثل الدوائر عبدي4) أو من الاستنسل5،،من67 يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الميكانيكي للخلايا وإزالة جزئية من البروتينات المصفوفة تستخدم لطلاء لوحات. وثمة عيب آخر من فحوصات رصد إقفال الجروح أو الخدوش هو دورتهم الوقت المحدود، كما يمكن فقط تحليل الهجرة الخلية حتى يتم إغلاق الصفر.
في إجراء المقايسة دوت، هي مطلي الخلايا كمستعمرة تعميم على لوحة مغلفة أو غير المصقول8. والأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية والطلاء هو الحصول على أوراق الخلية مع حواف محددة، يمكن ترحيل أو غزو في المناطق المحيطة بها خالية من الخلية دون الإخلال الثقافة بإزالة خلايا أو إدراج. والهدف العام للمقايسة دوت مراقبة الهجرة صحائف خلية مقاسا بحافة التشرد أو القطر مستعمرة، فضلا عن القيام بتصوير مرور الزمن لتحليل النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا في أعلى القرار الزمانية.
يمكن أن تتأثر الهجرة الخلية بالعديد من الإشارات ميكرونفيرونمينتال مثل المستقطبات، السيتوكينات، وعوامل النمو مثل مماثلة. لو هو عامل النمو التي تمارس إثارة البيولوجية عن طريق ربط لمستقبلات لها، لو مستقبلات9، ويزيد من السلوك الغازية والمنتشر من ورم الخلايا4،،من910. هنا، يتم استخدام المقايسة دوت لدراسة مماثلة وحفز الهجرة الخلية في مستعمرة الرئة بشرية الغازية، تشكيل الثدي سرطان الخلية خط (MCF10CA1a)8،،من1112.

<table style="border-collapse:collapse;width:659pt" width="878">
	<colgroup>
		<col style="width:302pt" width="402" />
		<col style="width:160pt" width="213" />
		<col style="width:131pt" width="175" />
		<col style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="width:302pt;height:15.75pt" width="402">MCF10CA1a cells</td>
			<td style="width:160pt" width="213">Karmanos Research Institute</td>
			<td class="xl18" style="width:131pt" width="175">N/A</td>
			<td style="width:66pt" width="88">cells used for asay</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">mouse collagen IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td class="xl18">354233</td>
			<td>used to coat plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">trypsin / EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">25300054</td>
			<td>used to remove cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DPBS&#160;</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td class="xl18">21-031-CV</td>
			<td>used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DMEM / F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">11320082</td>
			<td>used as culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">26050088</td>
			<td>used to supplement culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">12well glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td class="xl18">P12G-1.5-14-F</td>
			<td>used to grow cells for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid )</td>
			<td>Cayman</td>
			<td class="xl18">10093</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">EGF (epidermal growth factor, human recombinant)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td class="xl18">AF-100-15</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">A8806-1G</td>
			<td>used to make buffer for LPA and EGF</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">HHS32</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">eosin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td class="xl18">26051-10</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">37C, 5% CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td class="xl18">model MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td class="xl18">model Axio Observer.Z1</td>
			<td>used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">ORCA Flash LT sCMOS camera</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl21">C11440-42U-KIT</td>
			<td>used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Metamorph</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl18">MMACQMIC</td>
			<td>software used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td class="xl18">model IX70</td>
			<td>used to count cells and to check colonies in tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">plastic box</td>
			<td>Lock&#38;Lock</td>
			<td class="xl18">N/A</td>
			<td>used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the dot assay to analyze migration of cell sheets

على الرغم من أن الكائنات الحية معقدة تبدو ثابتة، أنسجتها تحت دوران مستمر. كما خلايا العمر، يموت، وهي الاستعاضة عن خلايا جديدة، الخلايا تتحرك داخل الأنسجة بطريقة مدبرة محكم. أثناء تطوير الورم، تشعر بالانزعاج هذا التوازن، وترك ورم خلايا ظهارة المنشأ لغزو المكروية المحلية، بالسفر إلى مواقع بعيدة، وتشكل في نهاية المطاف الأورام المنتشر في مواقع بعيدة. المقايسة دوت مقايسة هجرة غير مقيدة بسيطة، ثنائي الأبعاد، لتقييم صافي حركة أوراق الخلية إلى منطقة خالية من الخلية، وتحليل معلمات الهجرة الخلية باستخدام التصوير بمرور الزمن. وهنا يتضح المقايسة دوت استخدام الإنسان الغازية، ومستعمرة الرئة تشكيل خط خلية سرطان الثدي، MCF10CA1a، لتحليل استجابة للخلايا المهاجرة لعامل نمو البشرة (لو)، الذي يعرف بزيادة إمكانات خبيث لخلايا سرطان الثدي و لتغيير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا.

تم إجراء المقايسة دوت المعروضة هنا (الشكل 1) باستخدام الغازية، مستعمرة الرئة تشكيل خلايا سرطان الثدي (MCF10CA1a) كنظام نموذجي. المقايسة دوت غلة النقاط خلية استنساخه بشدة حتى في اليد للمبتدئين، يجعلها مريحة وسهلة لتنفيذ المقايسة (الشكل 1د</st...

Watch this Scientific Journal Video about Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets at JoVE.com

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

الهجرة الخلية أمر ضروري لتطوير وصيانة الأنسجة وإصلاح، توموريجينيسيس، ويخضع لعوامل النمو والمستقطبات السيتوكينات. ويصف هذا البروتوكول المقايسة دوت، مقايسة هجرة ثنائية الأبعاد، وغير المقيد لتقييم النمط الظاهري المهاجرة من أوراق خلية المرفقة، متماسك استجابة لمنبهات ميكرونفيرونمينتال.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

The overall goal of the dot assay is to assess the migratory phenotype of attached cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues. This method can help answer key questions in the cancer field, such as how cytokines or growth factors alter tumor cell motility. The main advantage of the dot assay is that it is easily performed and used for reproducible results.Though this method can provide insight into cell motility, it also lends itself to a range of subsequent assays, such as staining of cells to assess growth colony morphology and cell scattering, immunostaining, protein and DNA or RNA analysis, or injection of cells into animals. To begin, thaw mouse collagen four on ice, and dilute it with 50 micromolars HCL to prepare three milliliters of a 10 microgram per milliliter collagen four solution. Add 250 microliters of collagen four solution to the wells of 12-well glass-bottom plates, and place them into an appropriately sized, tight-closing plastic box.Place wet paper towel over and around the plates to manufacture a humid chamber, and close the box. Then, incubate the plates overnight at room temperature. The next morning, to move non-absorbed collagen and buffer, use deionized water to rinse the plates twice, directing the water to the edge of the plate well, rather than the edge formed by the edge bottom and the cover slip.Air dry the plates in a laminar flow hood, and use them immediately or store them at four degrees Celsius for up to five days. To prepare cell suspension, use cells that have been grown in a 60 millimeter tissue culture dish in DMEMF12 medium, supplemented with 5%horse serum to 80%confluence. Use calcium-and magnesium-free DPBS to rinse the cells once, then add 500 microliters of room temperature trypsin EDTA, and incubate the cells at 37 degrees Celsius in 5%CO2 in a humidified atmosphere for three to five minutes.Suspend the detached cells in 4.5 milliliters of culture medium to stop trypsin activity, and use a hemocytometer to count a 20 microliter aliquot of the cell suspension. Pull out the remaining cells in a 50 milliliter conical tube by centrifugation at 200 times gravity for three minutes. Then, aspirate the supernatant, and re-suspend the cells in culture medium to three times 10 to the six cells per milliliter.To plate the cells at the center of each coverslip of the collagen four coated 12-well glass-bottom plate, place a 10 microliter drop of cell suspension, taking care not to touch or scratch the coating. Plating of a non-circular drop will not yield a circular cell sheet, and if the coating is touched or scratched, it will prevent the cells from adhering well. Incubate the plate at 37 degrees Celsius in a humidified atmosphere for 30 minutes, to allow the cells to attach.Then, check for attachment under an inverted microscope. With one milliliter of culture medium, gently wash the wells twice, to remove non-attached cells, then add one milliliter of culture medium to each well. Check under an inverted microscope that no floating cells remain, otherwise wash the wells again.Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius in 5%CO2 in a humidified atmosphere to obtain well-defined cell sheets. Using an inverted microscope, check all the wells to ensure that cell colonies have grown properly. If necessary, mark unsuitable wells and do not use them.Label each well of the plate appropriately for each condition investigated. Run each condition in duplicate or triplicate. Change the medium to starve the cells in DMEMF12 containing 0.1%horse serum, three hours before cells are stimulated.Then, stimulate the cells by adding EGF or other desired mediators. Use a one microliter pipetter, or swirl the plate gently to mix the medium. Incubate the plate for one to four days to observe edge displacement and edge contour.To carry out the H and E staining, wash the cells with PBS twice and fix them for approximately two minutes. Add hematoxylin for approximately two minutes to stain the nuclei. Wash the cells with tap water for five to 10 minutes, until the nuclei are blue.Then, stain the cytoplasm with eosin for two minutes before rinsing the cells with deionized water. Air dry the plate, then flip it over and use a ruler to measure the dot diameter. Alternatively, take pictures of the plate with a camera, and use ImageJ to analyze the dot diameter.To carry out time lapse microscopy, switch on the incubator microscope, and adjust the temperature to 37 degrees Celsius. Fill the humidifier with DH2O, then adjust the CO2 to 5%Ensure that the incubator chamber is humidified, and that the motorized stage can move freely. Then, close the incubator chamber and allow the microscope to adjust to 37 degrees Celsius.Place the plate on the stage of the incubator microscope and set up the stage list, then image two opposing edges and the center of each cell dot. Using a 10X objective, take images every three minutes for 15 to 24 hours. Download the data and proceed with image analysis in a program of choice such as Matlab.Initially, phase-contrast imaging of cell dots revealed that invasive, lung colony-forming breast cancer cells maintain a mesenchymal phenotype after stimulation with EGF. However, single cells leaving the sheet are observed more frequently in EGF-stimulated cell dots. The response of lung colony-forming breast cancer cells to EGF was further assessed by H and E staining of cultures that were stimulated with EGF for four days.Indeed, EGF stimulation resulted in an increased colony diameter, indicating that migration of EGF-stimulated cells might be altered. In this dot assay, cells at the sheet edges were imaged for nine hours following stimulation of colony-forming breast cancer cells with EGF. PIV revealed that EGF increased cell speed to 0.63 micrometers per minute from 0.45 micrometers per minute in control cells.In addition, EGF reduced the variability of cell directionality, or angular spread, from 0.95 in control cultures to 0.79 in EGF-stimulated cultures. In addition, as was observed by H and E staining after four days, EGF increased the radial displacement of the epithelial edge over nine hours, from 257 micrometers to 356 micrometers. Once mastered, the hands-on time for this technique is a couple of hours.Following this procedure, other methods like time lapse imaging, immunostaining, and DNA and RNA analysis can be performed in order to answer additional questions. For example, it can be used to analyze if proteins are differentially expressed in fast or slow migrating cells, or when cells migrate into the surrounding environment. After watching this video, you should have a good understanding of how to set up the dot assay, and use it to assess the migratory phenotype of attached cohesive cell sheets in response to microenvironemntal cues.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

يعيش-تصوير الثدي الخلايا الظهارية الهجرة بعد استنفاد عابر TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل في المختبر

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

المعاوقة القائمة على قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا السرطانية والغزو

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

قياس طول التيلومير باستخدام الكشف عن التلألؤ الكيميائي غير المشع

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...