Name: an array-based comparative genomic hybridization platform for efficient detection of copy number variations in fast neutron-induced medicago truncatula mutants
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutant

המימון של עבודה זו מסופק בחלקו על ידי מענק של מחקר הגנום של הצמח NSF (IOS-1127155).

הערה: איור 1 מציג את השלבים חמש עבור המערך CGH פרוטוקול. הם: 1) הכנה של חומרים הצמח; 2) בידוד של דגימות די אן איי באיכות גבוהה; Labeling 3) ולטיהור דגימות די אן איי; 4) הכלאה, שטיפה, וסריקה של מערכים הגנום כולו; ו- 5) ניתוח נתונים CGH. מערכים ריצוף הגנום כולו מ truncatula מכילים סך של הגששים o...

<ol>
	<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+genome+release+(version+Mt4.0)+for+the+model+legume+Medicago+truncatula.">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312 (2014).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+neutron+bombardment+(FNB)+induced+deletion+mutagenesis+for+forward+and+reverse+genetic+studies+in+plants.">Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants.</a> Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).</li><li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicago+truncatula.">Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+components+of+the+ethylene-response+pathway+identified+in+a+screen+for+weak+ethylene-insensitive+mutants+in+Arabidopsis.">Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).</li><li>Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RGA+gene+encodes+a+transcriptional+regulator+repressing+the+gibberellin+signal+transduction+pathway.">The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway.</a> Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).</li><li>Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleteagene:+a+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+gene+knockout+system+for+plants.">Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants.</a> Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).</li><li>Bolon, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+genomic+analyses+of+a+fast+neutron+mutant+population+resource+in+soybean.">Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean.</a> Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).</li><li>Men, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Neutron+Mutagenesis+of+Soybean+(Glycine+soja+L.)+Produces+a+Supernodulating+Mutant+Containing+a+Large+Deletion+in+Linkage+Group+H.">Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H.</a> Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).</li><li>Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodulation+deficiency+caused+by+fast+neutron+mutagenesis+of+the+model+legume+Lotus+japonicus.">Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus.</a> J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+reverse+genetics+system+for+plants.">A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants.</a> Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).</li><li>Bourcy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medicago+truncatula+DNF2+is+a+PI-PLC-XD-containing+protein+required+for+bacteroid+persistence+and+prevention+of+nodule+early+senescence+and+defense-like+reactions.">Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions.</a> New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dissected+leaf+morphology+by+a+Cys(2)His(2)+zinc+finger+transcription+factor+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).</li><li>Ge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+seed+size+and+quality+by+manipulating+BIG+SEEDS1+in+legume+species.">Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).</li><li>Kalo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodulation+signaling+in+legumes+requires+NSP2,+a+member+of+the+GRAS+family+of+transcriptional+regulators.">Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators.</a> Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).</li><li>Oldroyd, G. E., Long, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nodulation-signaling+pathway+2,+a+gene+of+Medicago+truncatula+involved+in+Nod+actor+signaling.">Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling.</a> Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+compound+leaf+development+in+Medicago+truncatula+by+fused+compound+leaf1,+a+class+M+KNOX+gene.">Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene.</a> Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).</li><li>Tsujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+TOBAMOVIRUS+MULTIPLICATION+(TOM)+2+locus+encodes+a+transmembrane+protein+that+interacts+with+TOM1.">Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1.</a> EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nodule-specific+protein+secretory+pathway+required+for+nitrogen-fixing+symbiosis.">A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis.</a> Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).</li><li>Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+array-based+comparative+genomic+hybridization+to+clinical+diagnostics.">Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics.</a> J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).</li><li>Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+shapes+genome-wide+patterns+of+copy-number+polymorphism+in+Drosophila+melanogaster.">Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster.</a> Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).</li><li>Gong, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+rapid+cloning+of+an+ion+accumulation+deletion+mutant+in+Arabidopsis+thaliana.">Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).</li><li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+functional+impact+of+DNA+copy+number+variation+in+the+rat.">Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat.</a> Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).</li><li>Haun, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82.">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li><li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast.">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li><li>Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+(oaCGH)+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans.">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402 (2007).</li><li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis:+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens.">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li><li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development:+Gene+identification+by+transcript-based+cloning.">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li><li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome.">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381 (2008).</li><li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+expression+arrays+for+copy+number+detection:+an+example+from+E.+coli.">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).</li><li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation.">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li><li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medicago+truncatula+esn1+defines+a+genetic+locus+involved+in+nodule+senescence+and+symbiotic+nitrogen+fixation.">Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation.</a> Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).</li><li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length.">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li><li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide,+NCR169,+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant.">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis.">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li><li>. Medicago truncatula Mutant Database Available from: <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017)</li><li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray.">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li></ol>

פיתחנו פלטפורמה CGH מבוסס על מערך זיהוי, אפיון נייטרון מהיר הפגזה (FNB)-induced מוטציות ב truncatula מ cv. Jemalong A17. כדי להדגים את השימוש במערך CGH שיטת באיתור מוטציות, ביצענו ניתוח aCGH של המוטציה FN6191, אשר הציג הפנוטיפ היפר-nodulation בניגוד פראי סוג צמחים, כאשר מחוסן עם meliloti ס Sm1021. לניתוח פילוח, קטע הייתה...

קטניות (קטניות) הם משפחת השלישית בגודלה של צמחים בעלי פרחים, עם מינים רבים כלכלית כגון סויה (מקס גליצין), אספסת (סאטיבה אספסת). קטניות צמחים יכולים לקיים אינטראקציה עם חנקן-תיקון בחיידקים בקרקעות, בדרך כלל בשם Rhizobia לפתח פקעיות בו dinitrogen עם אווירה תקטן אמוניה לשימוש על ידי המפעל המארח. ככזה, טיפוח של גידולי קטניות דורש קלט הקטן של דשנים חנקן, ובכך תורמת חקלאות בת-קיימא. גידולי קטניות לייצר עלים וזרעים עם תוכן חלבון גבוהה, הגשה מצויינת מספוא וגרעינים. עם זאת, מינים קטניות מעובדים בדרך כלל יש מבנים מורכבים הגנום, ביצוע מחקרים פונקציונלי של גנים לשחק בתפקידי מפתח בתהליכים ספציפיים קטניות, מסורבלת. אספסת truncatula אומצה באופן נרחב כמין דגם ללימודי קטניות בעיקר בגלל זה (1) יש גנום דיפלואידי עם גודל הגנום הפלואידי קטן יחסית (~ 550 Mbp); (2) צמחים יכול להיהפך stably ללימודי פונקציונלי ג'ין; (3) זה קשורה קשר הדוק אספסת (סאטיבה מ'), המלכה מספוא, רבים כלכלית הגידולים החקלאיים ללימודי translational. לאחרונה, רצף הגנום של truncatula מ' cv Jemalong A17 כבר שוחרר1,2. ביאור של הגנום מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים החזוי או מודלים גנים בגנום. כדי לקבוע את הפונקציה של רוב בגנים truncatula מ' הגנום הוא משימה מאתגרת. כדי להקל על מחקרים פונקציונלי של גנים, אוסף מקיף של מוטציות בטווח של קווים1 מ' מעל 150,000 נוצרה באמצעות מוטגנזה מכוונת נייטרון מהיר הפגזה (FNB) ב- truncatula מ' cv Jemalong A173 ,4. נייטרון מהיר, מוטגן יינון אנרגיה גבוהה, שימש ליצירת מוטציות במינים רבים של צמחים, כולל תודרנית5,6, אורז (אורז sativa)7, עגבניות (סולנום lycopersicum), סויה (גליצין soja; ג'י מקס)8,9, (שעורה מצויה) שעורה ג'אפוניכאס לוטוס10. חלק גדול של מוטציות נגזר FNB מוטגנזה מכוונת הן בשל מחיקות הדנ א הזה מגוון גדול של כמה זוגות בסיס מגה בסיסי זוגות9,11. גנים הקשורים פנוטיפ רבים כבר בהצלחה מזוהה, מאופיין4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. בעבר, שיבוט מולקולרי של גנים הבסיסית של מוטציות FNB הסתמכה על גישה המבוססת על המפה, זמן רב ואינה מגבילה את מספר מוטציות כדי להיות מאופיין ברמה המולקולרית. לאחרונה, מספר גישות ללא תשלום כולל שיטות מבוססות על התעתיק, הגנום ריצוף מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) עבור זיהוי וריאציה מספר עותק ה-DNA ואת רצף הגנום כולו, יש כבר מועסקים כדי להקל אפיון של מחיקה מוטציות אורגניזמים מגוונים כולל בעלי חיים וצמחים20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
כדי להקל על אפיון FNB מוטציות ב- מ truncatula, הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) פלטפורמה פותחה, לאמת. כפי שדווח במערכות בעלי חיים, פלטפורמת CGH מבוסס על מערך מאפשרת גילוי של עותק מספר וריאציות (CNVs) ברמת הגנום כולו ב- FNB מ truncatula מוטציות. יתר על כן, נגעים יכול להיות מאושרות על ידי ה-PCR, מחיקת גבולות יכול להיות מזוהה על ידי רצף. בסך הכל, פלטפורמת array CGH הוא כלי יעיל ואפקטיבי בזיהוי נגעים ב truncatula מ FNB מוטציות. כאן, מומחשים array CGH הליך ואפיון PCR של מחיקת גבולות במוטציה FNB truncatula מ' .
להלן כללי התנהגות מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) ניתוח של מספר עותק וריאציות בצמחים. לדוגמה, אספסת truncatula FN6191 מוטציה שימש כדי לזהות אזורים המחיקה ואת המועמד גנים הקשורים פנוטיפים מוטציה. מוטציה FN6191 מ truncatula , במקור מבודד של אוסף מוטציה מחיקה הנוצרות על-ידי הפגזה נייטרון מהיר32 (ראה טבלה של חומרים), הציג הפנוטיפ היפר-nodulation לאחר חיסון עם האדמה חיידק, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , בניגוד פראי סוג צמחים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4123A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td>
			<td>In house</td>
			<td>FN6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)</td>
			<td>In house</td>
			<td>A17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureTag DNA Labeling Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>MJ research</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Labnet international Inc</td>
			<td>Spectrafuge 24D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilization and Drying Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber gasket slides</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber, stainless</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purification Columns</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>Roche</td>
			<td>MS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NimbleScan 2.6</td>
			<td>Roche Nimblegen</td>
			<td>5225035001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Map 1.9</td>
			<td>Roche Nimblegen</td>
			<td>Signalmap1.9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an array-based comparative genomic hybridization platform for efficient detection of copy number variations in fast neutron-induced medicago truncatula mutants

מוטציות הן כרב משאבים גנטי ללימודי תפקוד הגן. כדי ליצור אוספים מוטציה, שלושה סוגי מוטגנים יכול להיות מנוצל, כולל ביולוגית כגון T-DNA או transposon, כימיקלים כגון אתיל methanesulfonate (EMS), או גופני כגון קרינה יינון. הסוג של מוטציה נצפתה משתנה בהתאם מוטגן בשימוש. למוטנטים הקרינה הנוצרות על ידי יינון, מוטציות כוללות מחיקה, שכפול או סידורם מחדש. בזמן T-DNA או מבוססי transposon מוטגנזה מכוונת מוגבלת מינים רגישים טרנספורמציה, ניתן ליישם מוטגנזה מכוונת כימיים או פיזיים מגוון רחב של מינים. עם זאת, אפיון מוטציות נגזר כימיים או פיזיים מוטגנזה מכוונת באופן מסורתי מסתמך על מבוסס מפה שיבוט בגישה, אשר עבודה אינטנסיבית וצורכת זמן. . הנה, אנחנו מראים כי פלטפורמה מבוססת על מערך השוואתי גנומית הכלאה (aCGH) הגנום בצפיפות גבוהה ניתן ליישם ביעילות לזהות ולאפיין עותק מספר וריאציות (CNVs) של מוטציות נגזר מוטגנזה מכוונת הפגזה (FNB) נייטרון מהיר ב אספסת truncatula, זן קטניות. ניתוח רצף הגנום כולו מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים או דגמים ג'ין truncatula מ'. בבית הנוכחי, הנוצרות על-ידי FNB מוטציות במ truncatula נגזרים מתוך יותר מ-150,000 שורות M1, המייצג משאבים גנטי לא בפז עבור מחקרים פונקציונלי של גנים בגנום. פלטפורמת aCGH המתוארים כאן הוא כלי יעיל עבור אפיון FNB-induced מוטציות ב- truncatula מ'.

איור 2 מציג את ההתפלגות של יומן מנורמל2 יחסי של מוטציה לעומת WT אותות ברחבי הגנום כולו. ניתוח של נתונים CGH גילה משוער 22 kb מחיקה על כרומוזום 4 שמקיף את הגן כולו טרופ 33 ועוד כמה מבואר גנים מוטציה FN6191 (איור 2, איו?...

Watch this Scientific Journal Video about An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutant

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

The overall goal of this array-based comparative genomic hybridization protocol is to rapidly identify copy number variations in fast neutron bombardment induced mutants of the legume plant Medicago truncatula. This method helps to answer key questions in the field of legume biology. Such as, facilitating identification of empathogens on low site involved in regulating nodule development in legumes.The main advantage of this technique is that it is of highest repute and sensitive in detecting copy number variations such as deletion mutations in the neutron bombardment mutants of the legume plant Medicago truncatula. Demonstrating this procedure will be myself, and Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows from Genetic Lab. Quickly freeze one gram of young leaf tissue collected from single plants in liquid nitrogen.Then, use a mortar and pestle and grind the frozen leaf tissue to fine powder within the liquid nitrogen. Extract the wild type and mutant genomic DNA samples from the fine powder using a DNA isolation kit. Use 500 microliter centrifuge tubes to dilute one microgram of each wild type and mutant genomic DNAs with double distilled water to a final volume of 20 microliters.Then, add five microliters of random primer to the centrifuge tubes. Quickly vortex the tubes, and after a quick spin down place them in a thermocycler for 10 minutes to denature the DNA samples at 98 degrees Celsius. After 10 minutes remove the tubes from the thermocycler, and instantly place them on ice water for five minutes.Then, prepare two labeling mixes and add 25 microliters of labeling mix as one and two to the wild type and mutant DNA tubes respectively. Pipette the DNA and the labeling mix three times, and then briefly spin the tubes. After spinning, incubate the tubes in the thermocycler at 37 degrees Celsius for two hours, and then at 65 degrees Celsius for 20 minutes to inactivate the exo Klenow enzyme.Then, add 430 microliters of One X TE Buffer, and mix the contents in each tube. Next, briefly spin the tubes and transfer the solution in the tubes to purification columns with two milliliter collection tubes. Centrifuge the purification columns at 14, 000 times G for 10 minutes and discard the flow through.Add 480 microliters of One X TE Buffer to each column, and again centrifuge at 14, 000 times G for 10 minutes. Discard the flow through. Transfer each of the wild type and mutant labeled DNAs from the bottom of the column to new centrifuge tubes.After measuring the volume of each of the labeled DNAs with the pipette adjust the final volume to 80 microliters with One X TE Buffer, then measure the concentration of the labeled DNAs in a spectrophotometer. Next, mix equivalent volumes of mutant and wild type DNAs to hybridize probes on a micro array chip for comparative hybridization. Bring the final volume to 160 microliters with One X TE Buffer.Next, prepare the hybridization solution and pipette it three times to mix three agents well with mixed DNA. After briefly spinning the tubes incubate them in a thermocycler at 98 degrees Celsius for 10 minutes, and at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Remember to set the temperature to 67 degrees Celsius to preheat the hybridization oven four hours before hybridization.Then, place a gasket slide on the base of the hybridization chamber and load 490 microliters of the hybridization solution onto it after 20 minutes of incubation at 37 degrees Celsius in the thermocycler. To form the hybridization chamber cover the gasket slide with Medicago truncatula genome micro array chip, then cover the hybridization chamber and securely tighten it with the clamps. Incubate the assembled hybridization chamber in the hybridization oven at 67 degrees Celsius for 40 to 48 hours.Meanwhile, prepare two slide washing dishes with 250 milliliters of Washing Buffer One kept at room temperature. Then, make one slide washing dish with Washing Buffer Two kept at 37 degrees Celsius. Then, prepare one slide washing jar with 70 milliliters of acetonitrile, and another slide washing jar with 70 milliliters of stabilization and drawing solution.Place both the slide washing jars in a fume hood at room temperature. After incubation remove the hybridization chamber from the hybridization oven and loosen the chamber clamps to open the cover. Then, remove the micro array chip in the gasket slide and place them on slide washing dish with Wash Buffer One.Isolate the micro array chip from the cover slide. Next, transfer the micro array chip to the second slide washing dish with Wash Buffer One. Using a stir bar, gently stir the solution on a magnetic stir plate at room temperature for five minutes.Place the micro array chip on the slide washing dish with pre-warmed Washing Buffer Two, then stir with the stir bar to wash the solution at 37 degrees Celsius for one minute. Remove the micro array chip and place it in the acetonitrile containing slide washing jar in a fume hood to wash for 30 seconds. Transfer the micro array chip to the slide washing jar with stabilization and drying solution and wash again for 30 seconds.Carefully remove the chip and dry for one minute inside the fume hood. Scan the micro array chip using a scanner under two micrometer resolutions. A signal mapping software was used as an interface to analyze the distribution of normalized log two ratios of mutant versus wild type signals across eight chromosomes.For putative deletions value of log two ratio equal to or less than minus two point five standard deviation is considered. Segmentation analysis of the software demonstrates an estimated 22 kilobase deletion region on chromosome four shown in the graph. Analysis of the deletion borders flanked by the micro array probes show a reduced mean normalized log two ratio.The graph also shows six other annotated genes including the son gene encompassing the deleted region. Son gene is responsible for controlling nodulation in Metecago truncatula. Next, PCR amplification done to confirm the deletion borders shows a one point five kilobase product amplified from FN6191 mutant, but not in the wild type.DNA sequencing was done to show the deletion junction in FN6191 mutant shown in the black arrow. Sequencing was also done that confirmed the location of the deletion borders. Once mastered, this technique can be completed in 72 hours if it is performed properly.To obtain high quality data, remember to keep the ozone concentration low in the room where performing the procedure. Following this procedure, other measures such as polymerase chain reactions of all genome sequencing can be performed to answer additional questions like the size and the copy number variations in the genome. Event and validation of this technique has paved the way for researchers to explore copy number variation they induce to mutants and the natural variants in plant species that are not amenable to insertional mutagenesis such as Garden P.Don't forget that working with acetonitrile, stabilization and drying solution can be extremely hazardous.Precautions, such as wearing eye proctection, avoiding direct contact with the agents, and working careful is absolutely essential.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Unit 2

Genomes and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

מינוף משאבים CyVerse עבור<em&gt; דה נובו</em&gt; תמלול השוואתי של אורגניזמים לא מקופחים (לא מודל)

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...