Name: application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium at JoVE.com

Vi tackar Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) och Dr Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) för att tillhandahålla vissa plasmider. Projektet stöddes av anslag från National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 och GM122552 till West).

1. NIH-3T3 cell förberedelse för hastighet mikroskopi lagervara
<ol><li>1,5 veckor i förväg om experimentet, återställa en ny kultur av NIH-3T3-celler från en fryst lager av upptining vid 37 ° C och överföra cellerna till en 25 cm2 cell kultur kolv med 3 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 110 mg/mL natrium pyruvat, 2 mM glutamin, 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin.</li>
	<li>Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots.">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li><li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex.">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore.">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy.">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li><li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li><li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+transition+zone:+from+morphology+and+molecules+to+medicine.">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li><li>Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell.">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li><li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope:+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles.">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue.">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639 (2010).</li><li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia:+tuning+in+to+the+cell's+antenna.">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li><li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling.">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li><li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone.">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096 (2015).</li><li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content.">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li><li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia.">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li><li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia.">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li><li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+to+the+ciliary+membrane:+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier.">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors.">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654 (2013).</li><li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates.">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li><li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia.">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li><li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin.">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Det här protokollet beskriver tillämpningen av hastighet mikroskopi till den primära cilier, en cellulär signalering organell som är starkt beroende av effektiv proteintransport. HASTIGHET mikroskopi kan ge hög upplösning (< 10 nm) platser för fluorescently-märkta molekyler när de passerar genom den enda punkt belysning centreras på TZ. Den har tidigare använts för att studera proteinet människohandel genom den NPC6,7,8<...

Eftersom anges av Ernst Abbe 1873, har upplösningen av konventionella ljusmikroskopi varit tros vara begränsad till ungefär 200 nm på grund av ljus diffraktion från mål1,2. För närvarande super-resolution ljusmikroskopi tekniker bryta denna begränsning och tillåta fångst av dynamiska bilder med sub diffraktion (< 200 nm) upplösning. Teknikerna generellt faller i två breda kategorier: stimulerat utsläpp utarmning (STED) mikroskopi baserat tillvägagångssätt, som genererar sub diffraktion belysning volym på grund av olinjära optiska svar av fluorophores i prover3; och photoactivated ljusmikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)-baserade super resolution-teknik, som utnyttjar matematiska funktioner för att lokalisera centroids av fluorophores och sedan rekonstruera dessa centroids att bilda super-upplösning bilder4,5. För närvarande, på grund av den relativt okomplicerade optiska setup anställda PALM och STORM i stor utsträckning genom att aktivera endast en liten delmängd av fluorophores i varje bildruta i en lång video biologiska preparat. Detta möjliggör mer exakt lokalisering av 2D Gaussisk montering av fluorescerande plats, kallas den punkt sprida funktionen (PSF), av fluorescently-märkta proteiner i varje bildruta i videon. 2D platsen för varje fluorescently-märkt molekyl kan sedan vara ovanpå en enda tänkbar plan att skapa en super-upplösning bild av biologiska beredning1,2. Medan dessa singel-molekyl lokalisering, super-upplösning förhållningssätt till mikroskopi verkligen revolutionerade hur avbildning av biologiska prover utfördes, det finns fortfarande utmaningar som måste övervinnas. Till exempel kan STORM PALM uppnå sin bästa rumsliga upplösningar efter fixering av biologiska prover och därigenom presentera en statisk representation av fluorescently-märkta proteiner, som är en liknande begränsning av elektronmikroskopi. Dessutom, för att uppnå hög rumslig upplösning för varje fluorescently-märkt protein i levande celler, måste prover avbildas på mycket lång framerates som inte kan fånga protein dynamics. Det är därför nödvändigt att övervinna dessa huvudsakliga tekniska hinder.
För att erhålla en hög spatiotemporal upplösning som är väl lämpad för att påvisa snabba proteiner eller RNAs i levande celler, har vi utvecklat super-resolution mikroskopi hastighet i vårt laboratorium (figur 1)6,7, 8. flera stora tekniska framsteg i hastighet mikroskopi tidigare har aktiverat oss att framgångsrikt spåra nucleocytoplasmic transport av små molekyler, proteiner, mRNA och virus via native nukleära porstorlek komplex (NPC)6, 7 , 8. Sammanfattningsvis följande funktioner i hastighet mikroskopi används för att spåra snabbrörliga makromolekyler via sub mikrometer rotationssymmetrisk strukturer i levande celler, såsom NPC och primära cilier: (1) en lutande eller en vertikal belysning polyesterstapelfibrer möjliggör excitation av enstaka molekyler inom en liten diffraktion-limit volym i fokalplanet (figur 1). (2), lutande polyesterstapelfibrer kan kraftigt undvika out-of-fokus fluorescens och därmed förbättra signal-brus-förhållandet. (3) optiska densitet 100-500 kW / cm2 i belysningen polyesterstapelfibrer tillåter tusentals fotoner som ska samlas in från enda fluorophores med snabb detektering hastigheter (> 500 Hz). (4), snabbt upptäckten hastighet reducerar också kraftigt singel-molekyl rumsliga lokalisering felet (< 10 nm) vid fastställandet av de rumsliga banor av rörliga fluorescerande molekyler i levande celler, eftersom molekylär diffusion är en av viktigaste faktorerna orsakar ojämnheter på singel-molekyl lokalisering för att flytta molekyler. (5) väletablerade 2D till 3D transformation algoritmer kan vi ge 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartor över transportvägar för molekyler i NPC eller den primära cilier. Det är anmärkningsvärt att våra konverteringen mellan den kartesiska och cylindriska samordningssystem används för att generera en 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten karta i stället för 3D singel-molekyl spårning (figur 2). Elektronmikroskopi data har tidigare avslöjat att de NPC9,10 och primära cilier11 båda har en rotationssymmetrisk struktur. I princip bör slumpmässigt sprida molekyler rör sig genom den NPC eller primära cilier också ha rotationally symmetriska fördelningar. I figur 2visas ett stort antal slumpmässigt sprida molekyler inuti cylindern skulle generera rotationssymmetrisk distributioner på vyn tvärsnitt som i NPC, ytterligare resulterar i en ca enhetlig rumslig distribution inom varje liten delregion mellan två angränsande ringar (figur 2E). Denna enhetliga distribution leder att den rumsliga fördelningen längs θ dimension i cylindriska systemet är konstant. De 3D-koordinaterna (X, R, θ) kan då förenklas för att vara de 2D-koordinaterna (R, X, konstant). Egentligen är vår konverteringen mellan den kartesiska och cylindriska system från 2D (X, Y) till 2D (R, X, konstant). Den konstanta θ, hänvisar till den rumsliga density p i figur 2E, beräknas med hjälp av ekvation A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
I slutändan, singel-molekyl spårning har bred tillämpning inom biologisk forskning, därför är det naturligt att en uppsjö av tekniker kommer att utvecklas för att fylla specifika biologiska nischer12,13,14. Så är fallet med hastighet mikroskopi. Tidigare, när tillsammans med en 3D transformation algoritm, denna teknik utvecklades lös 3D transportvägar av transiteras molekyler genom NPC, en sub-diffraction-stora och rotationally symmetriska biologiska struktur6. I detta papper visat primära cilier sig utmärkt modell organeller samt. Primära cilier är cylindriska, antenn-liknande organeller (~ 125 nm radie) att projektet från ytan av mest däggdjur celler15,16,17. De är ansvariga för att ta emot externa signaler och sända en intracellulär svar som vanligtvis förknippas med tillväxt och metabolism15,16. Därför flux av strukturella proteiner, återvinning av transmembrana receptorer, och överföring av intracellulära budbärare är vitala ansvar av primära cilier. Vid tidpunkt mellan den primära cilier och cellkroppen är en kritisk selektivitet barriär, kallas övergångszon eller TZ, genom vilken alla denna proteintransport ske11,18,19, 20. Förutom funktionen Usenets av TZ tros minst två processer, intraflagellar transport och passiv diffusion, vara ansvarig för förflyttning av protein genom denna region16,21, 22. från människors hälsa synpunkt, förlusten av primära cilier och efterföljande avregleringen av nedströms signalering är karakteristisk för många cancerformer. Dessutom är många genetiska sjukdomar, såsom Bardet-Biedl syndrom och polycystisk njursjukdom, associerade med defekt protein transport23. Både sub diffraktion begränsa storleken och den komplexa processen att selektiv proteintransport genom TZ gör den primära cilier ett favoritmål för denna teknik. I detta metoder papper, kommer vi att visa spårning av en ciliär transmembrane protein, somatostatin receptor 3 (SSTR3)24, märkt externt med Alexa Fluor 647 och en komponent i IFT, IFT2025, märkt med en smält GFP-molekyl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:123px;">25 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:204px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">VV-01936-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">15140122</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10438018</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10566-016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">OPTIMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">31985062</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Trypsin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P3813-1PAK</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:204px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 2300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">35 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:204px;">MatTek</td>
			<td style="width:101px;">P35GCOL-0-14-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S21374</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Biotin</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B4501-100MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">633 nm He-Ne laser</td>
			<td style="width:204px;">Melles Griot</td>
			<td style="width:101px;">25-LHP-928-249</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">561 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">OBIS 561-50 LS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">488 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">1185053</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">IX81</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:123px;">1.4-NA 100&#215; oil-immersion apochromatic objective</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">UPLSAPO 100&#215;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:123px;">On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td>
			<td style="width:204px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:101px;">Cascade 128+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Dichroic filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">Di01- R405/488/561/635-25x36</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Emission filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">NF01-405/488/561/635-25X5.0</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Slidebook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">digital microscopy software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

Den primära cilier är en mikrotubulära-baserade utstick på ytan av många eukaryota celler och innehåller ett unikt komplement av proteiner som fungerar kritiskt i cell motilitet och signalering. Eftersom flimmerhåren är oförmögna att syntetisera sina egna protein, behöver nästan 200 unika ciliär proteiner vara trafikerade mellan cytosol och primära cilier. Det är dock fortfarande en teknisk utmaning att mappa tredimensionella (3D) platser för transport vägar för dessa proteiner i levande primära cilier på grund av begränsningarna i befintliga tekniker. För att erövra utmaningen, har nyligen vi utvecklat och sysselsatt en höghastighets virtuella 3D super-resolution mikroskopi, kallas enpunkts-edge-magnetiseringen sub diffraktion (hastighet) mikroskopi, för att fastställa transport vägar för 3D rumsliga position båda cytosoliska proteiner och membranproteiner i primära cilier av levande celler. I den här artikeln kommer vi att visa detaljerade inställningar för hastighet mikroskopi, beredning av celler som uttrycker fluorescens-protein-märkt ciliär proteiner, de enda-molekyl realtidsspårning av enskilda proteiner i levande cilie och prestationen av 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartor över transportvägar för ciliär proteiner.

Detta avsnitt visar de uppgifter som erhållits från att utföra hastighet mikroskopi på TZ av primära cilier att studera transport rutten av SSTR3 ansluten av en ~ 15 nm externa länkare till Alexa647 (figur 3A). Det tjänar det dubbla syftet att verifiera 3D transformation algoritmen. Alexa647 bör endast etikett den yttre ytan av den primära cilier och därför 3D transportvägen bör avslöja en hög densitet transportsträcka på den...

Watch this Scientific Journal Video about Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium at JoVE.com

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Nyligen kartlagt vi de tredimensionella (3D) rumsliga platserna av transportvägarna för olika proteiner translocating inuti primära cilier i levande celler. Här lever detta papper Detaljer den experimentella setup, processen för biologiska prover och dataanalyser för 3D super-upplösning fluorescensen imaging strategi nyligen tillämpats i primära cilier.

Tillämpningen av höghastighetståg super-resolution hastighet mikroskopi i levande primära cilier

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

The overall goal of this experiment is to identify protein transport routes in primary cilia. This method can help answer key question in the cilia field, such as protein transport route differences in normal and dysfunctional cilia. The main advantage of this technique is that it has high enough resolution to see subdiffraction protein transport routes in live cells.To begin, thaw frozen stock of specially engineered of NIH-3T3 cells at 37 degrees Celsius, one and a half weeks in advanced of the experiment. Transfer the thawed cells to a 25 centimeter squared cell cultured flask containing three milliliters of pre-warmed media. Maintain the cells at 37 degrees Celsius in a 5%carbon-dioxide incubator.Culture the cells until they reach 80%confluency and then split the cells. In order to split the cells, trypsinize them with 0.25%Trypsin for two minutes at 37 degrees Celsius. Following the brief incubation, aspirate the Trypsin and replace it with two milliliters of pre-warmed culture media.Pipette the media to break up any cell clusters, then remove 75%of the cells from the flask and bring total volume of media back up to three milliliters. Split the cells at least three times before the experiment to ensure homogeneity of their cell cycle. Two days before the experiment, split the cells and plate them 60-70%confluency on a 35 millimeter glass bottom plate with 1.5 milliliters of the same culture medium.Then, one day before the experiment, chemically transfect the cells with the desired plasmid. Mix 500-1000 nanograms of the plasmid in a one to 2.5 ratio with transfection reagent and 0.25 milliliters of reduced serum media without antibiotics for 30 minutes. Once the transfection complex has formed, aspirate the media from the 35 millimeter glass bottom dish and replace it with the 0.25 millimeters transfection mixture and an extra 1.25 millimeters of reduced serum media without antibiotics and return the plate to the incubator.For cells with externally labeled SSTR3 construct, remove the media from the glass bottom dish one hour before the experiment. Wash the cells five times with one milliliter of PBS and add one milliliter of reduced serum media supplemented with one micromolar of Alexa 647 conjugated streptavidin. No more than 15 minutes before the experiment, remove media from the glass bottom dish and wash the cells five times with one milliliter of PBS.Then add one milliliter of the imaging buffer into the glass bottom dish. Affix the glass bottom plate to the stage in the microscope. Find a GFP express cell using the GFP filter set and locate a cell that is properly expressing SSTR3-GFP in a primary cilia.Once a suitable cell has been found, align the NPHP4-mCherry spot at the base of the primary cilia with the location on the imaging plane that corresponds to the laser's single point illumination. Using the snap function, in the camera tab of the focus controls window, capture an epifluorescence image of NPHP4-mCherry and SSTR3 proteins tagged with green fluorescence protein. Once the reference images are obtained, locally reduce the concentration of labeled single molecules by photobleaching the transition zone with a one milliwatt laser illumination for 20 seconds.To prepare for single molecule tracking, reduce the laser illumination power to 0.5 milliwatts for molecules labeled with Alexa 647. Set the gain and intensification to maximum and the frame rate to two milliseconds. Then click the stream button in the camera tab of the focus controls window and engage the appropriate illumination laser.Record the non-photobleached labeled single molecules as they are transported through the photobleached region of the transition zone. And remember to record no more than two minutes of video to avoid the effects of ciliary drift. After capturing the single molecules, process the videos using a 2D Gaussian fitting algorithm such as Glimpse by the Gelles lab, which precisely localizes the centroid of each single molecule's excitation point, spread function, and an encompassing area of interest.Finally, select all single molecule locations with a precision better than 10 nanometers and correct the center of the cilia based on the distribution of single molecule locations fitted with a 2D Gaussian function. As described in this video, single point illumination can be used to track an AF647 tagged SSTR3 molecule through the transition zone marked by NPHP4-mCherry. Before data analysis, superimposing the single molecule video on the wide field illumination is a useful validation step to make sure the laser is properly aligned, and that there is a adequate signal-to-noise ratio.Imaged here is a cell with a primary cilium identified by the staining. IFT20 is component of the intraflagellar transport complex which carries cargo along microtubules inside primary cilia, marked by Arl13b-mCherry. Once identified, speed microscopy is used to track individual IFT20-GFP proteins.Next, and 2D to 3D transformation algorithm is used to produce the spatial probability density distribution of the protein inside primary cilia along a single dimension. This high density region likely colocalizes with the axonemal microtubules in agreement with the known location of the intraflagellar transport route. While attempting this procedure, it's important to precisely align the sample with the laser to minimize systematic error.After watching this video, you should have a good understanding of how to do single molecule tracking with speed microscopy and you will know how to obtain single molecule transport route in primary cilia.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Cells and their Components

SCIENTISTS IN ACTION

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

High Speed ​​Droplet-baserade Delivery System för passiva Pumpning i mikroflödessystem enheter

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Live Primärceller

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensionell Super Resolution mikroskopi av F-aktinfilament av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...