Name: induction and micro-ct imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00
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Les auteurs remercient les installations et l’assistance scientifique et technique de la microscopie de Sydney &amp; microanalyse Research Facility (AMMRF) et le Centre australien pour la microscopie &amp; microanalyse (APD) à l’Université de Sydney. Ces études ont été pris en charge par l’Australian National Health et projet Medical Research Council (NHMRC) grant 161558 et APP1124011 (XZ).

tous les protocoles et éthique animale ont été approuvées par le Sydney Health District Animal Welfare Comité Local et animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université médicale de Tianjin. Toutes les expériences se sont déroulées sous les directives et règlements du centenaire Institute, University of Sydney et Université médicale de Tianjin 1. Induction of Cerebral Cavernous Malformations chez les modèles murins <ol><li>Cross Cdh5-CreErt2 ; Ccm2...

<ol>
	<li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations:+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis.">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li><li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li><li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+mutations+in+CCM1,+encoding+KRIT1,+cause+hereditary+cavernous+angiomas.">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li><li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1,+a+Krev-1/rap1a+binding+protein,+cause+cerebral+cavernous+malformations+(CCM1).">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li><li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li><li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li><li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease.">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li><li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice.">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li><li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice.">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor.">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li><li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease.">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation.">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li><li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice.">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2/4+signalling.">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11 (2009).</li><li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping.">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast.">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth.">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li></ol>

CCM est une malformation vasculaire commune qui affecte jusqu'à 0,5 % d’individus1. CCM peut se produire sous forme sporadique ou familiale. Pronostic de patients est souvent obscure comme lésions CCM peuvent entraîner une rupture inattendue pour provoquer des accidents vasculaires cérébraux et autres conséquences neurologiques. Actuellement, l’option seul traitement consiste à enlever chirurgicalement les lésions qui s’accompagnent d’un risque élevé.
...

CCM sont à parois minces, dilaté des malformations vasculaires dans le cerveau avec une prévalence de 0,5 % dans la population humaine1. CCM peut être héritée comme un trouble dominant due à des mutations perte de fonction dans l’un des trois gènes : CCM1 (aka Krit1), CCM2et CCM3 (également appelé PDCD10)2,3,4 ,5,6. Ces gènes sont présents dans un seul complexe de signalisation.
Divers modèles ont été développés pour la maladie humaine de CCM modèle et comprendre les voies en aval des gènes CCM qui sont responsables de la CCM7,8,9,10. Le modèle plus robuste consiste à supprimer sous condition l’un des gènes Ccm avec tamoxifène-inducible Cdh5-CreERT2 P1 dans nouveau-nés8,10. Ces petits développent des lésions dans le cerveau de P6 onward CCM et sont censées être un modèle idéal pour les études précliniques dans recherche de mécanismes et d’agents thérapeutiques dans le traitement des maladies de la CCM.
Fardeau de lésion CCM dans le cerveau de souris a été mesurée principalement par des méthodes basées sur l’histologie, une approche qui est chronophage et sous réserve de l’enquêteur biaiser10,11,12. MRI basée méthodes ont été utilisées pour évaluer la charge de lésion CCM dans le modèle de souris adulte9,13. Toutefois, un hautement spécialisés petits animaux MRI instrument et un long temps de numérisation de plusieurs heures à la nuit est nécessaire pour parvenir à une solution satisfaisante à l’identification des lésions CCM. En outre, si MRI peut être utilisé pour détecter les lésions de la CCM en souris néonatales n’a été signalé et résolution peut-être limiter la sensibilité.
Nous avons récemment mis au point une technique de micro-CT de l’image et d’analyser les CCM lésion14,15. Cette haute résolution, temps et méthode rentable boosté considérablement la valeur du modèle maladie CCM dans les études mécanistiques et thérapeutiques. Amélioration de contraste, toute monture coloration méthodes ont été utilisées pour l’imagerie des tissus mous et des embryons de souris16,17micro-CT. Auparavant, nous avons utilisé une coloration de base osmium pour renforcer le contraste pour l’imagerie des lésions de la CCM en cerveau14micro-CT. Dans cet article, nous avons utilisé une moins toxiques, non destructive, et réactif rentable, un iode Lugol solution, pour renforcer le contraste pour l’imagerie micro-CT basée sur. Iode peut se diffuser dans tout le cerveau et a une forte affinité pour le sang18.
Le protocole détaillé est présenté ici pour l’induction des lésions CCM dans un modèle de souris néonatales avec l’imagerie et l’analyse des lésions CCM avec un contraste base micro-CT. Cette méthode basée sur des micro-CT permet la quantification globale du volume de lésion CCM, identifie avec précision le nombre et l’emplacement 3D des lésions CCM dans le cerveau de souris et réduit considérablement le coût et temps requis au phénotype de ces animaux.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >4-hydroxy tamoxifen</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H6278</td>
			<td >To activate Cdh5-CreErt2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corn oil</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8267-500ML</td>
			<td >To dilute 4-hydroxy tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M205FA</td>
			<td >To take macroscopic images</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lugol&#39;s Iodine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L6146</td>
			<td >To stain samples for contrast micro-CT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic paraffin film</td>
			<td >Parafilm</td>
			<td >PM992</td>
			<td >To package samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro-CT</td>
			<td >Xradia</td>
			<td >MicroXCT-400</td>
			<td >Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D rendering software</td>
			<td >FEI Visualization Science group</td>
			<td >Avizo 3D image processing software</td>
			<td >To analyse micro-CT scans</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and micro-ct imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model

Des mutations dans le CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gène cause malformation caverneuse cérébrale (CCM) chez les humains. Modèles murins de la maladie de la CCM ont été établis par tamoxifène induite par délétion de gènes de Ccm chez les animaux après la naissance. Ces modèles de souris offrent des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires et des approches thérapeutiques pour la maladie de CCM. Une méthode précise et quantitative pour évaluer la progression et le fardeau de la lésion est indispensable pour exploiter la pleine valeur de ces modèles animaux. Ici, nous démontrons l’induction de la maladie dans un modèle murin CCM et l’utilisation du contraste amélioré la méthode de (micro-CT) micro tomographie par rayons x mesure CCM fardeau de lésion dans le cerveau de souris. Jours après la naissance 1 (P1), nous avons utilisé 4-hydroxytamoxifen (4HT) pour activer l’activité recombinase Cre du transgène en conjonction avec l’allèle floxed de Ccm2Cdh5-CreErt2. Des lésions dans le cerveau de souris CCM ont été analysées à P8. Pour micro-CT, de base d’iode Lugol a été utilisé pour renforcer le contraste dans le tissu cérébral. Nous avons optimisé les paramètres de numérisation et utilisé une dimension voxel de 9,5 µm, conduisant à une taille minimale de 25 µm environ. Cette résolution est suffisante pour mesurer le nombre et le volume de lésion CCM dans le monde et avec précision et garantir la qualité de cartographie 3D de lésions CCM dans le cerveau de souris. Cette méthode augmente la valeur des modèles souris établi pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour CCM et autres maladies cérébro-vasculaires.

Une seule injection de 4HT P1 a été suffisante pour induire des lésions CCM dans le cervelet. Lugol iode contrasté micro-CT suffisamment décelé des lésions de la CCM et pourrait quantifier son volume et nombre. En utilisant le micro-CT optimisée, nous imagés lésions CCM dans les hindbrains de Ccm2iECKO souris. Radiographies numérisées ont été reconstruites pour produire des images 3D du cerveau de souris, ce qui a permis la visualisation des lésions ens...

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Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Ce protocole montre l’induction de la maladie dans un modèle murin de malformation caverneuse cérébrale et utilisations contraste amélioré micro tomographie par ordinateur pour mesurer le fardeau de la lésion. Cette méthode améliore la valeur établie de modèles de souris pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour malformation caverneuse cérébrale et autres maladies cérébro-vasculaires.

Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

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