Name: induction and micro-ct imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00
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Gli autori riconoscono le strutture e l'assistenza scientifica e tecnica di microscopia del Sydney &amp; microanalisi Research Facility (AMMRF) e il centro australiano per microscopia &amp; microanalisi (ACMM) presso l'Università di Sydney. Questi studi sono stati sostenuti da Australian National Health e il progetto del Consiglio di ricerca medica (NHMRC) concedere 161558 e APP1124011 (XZ).

tutti i etica animale e protocolli sono stati approvati dal The Sydney salute distretto Animal Welfare comitato locale e istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) di Tianjin Medical University. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida/regolazioni del centenario Institute, Università di Sydney e Università medica di Tianjin 1. Induzione delle malformazioni cavernose cerebrali in modelli murini <ol><li>Croce Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl topi c...

<ol>
	<li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations:+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis.">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li><li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li><li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncating+mutations+in+CCM1,+encoding+KRIT1,+cause+hereditary+cavernous+angiomas.">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li><li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1,+a+Krev-1/rap1a+binding+protein,+cause+cerebral+cavernous+malformations+(CCM1).">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li><li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li><li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations.">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li><li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease.">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li><li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice.">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li><li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice.">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor.">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li><li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease.">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation.">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li><li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice.">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2/4+signalling.">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11 (2009).</li><li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping.">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast.">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth.">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li></ol>

CCM è una malformazione vascolare comune che colpisce fino allo 0,5% di individui1. CCM può verificarsi in forma sporadica o familiare. Prognosi paziente spesso non è chiara come le lesioni CCM possono rompersi in modo imprevisto per causare ictus e altre conseguenze neurologiche. Attualmente, l'unica opzione di trattamento è di rimuovere chirurgicamente le lesioni, che sono accompagnate da ad alto rischio.
Condizioni umane CCM recentemente sono state riprodotte in ...

CCM sono con pareti sottili, dilatata malformazioni vascolari del cervello con prevalenza fino a 0,5% nella popolazione umana1. CCM può essere ereditato come un disordine dominante dovuta a mutazioni di perdita-de-funzione in uno dei tre geni: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (chiamato anche PDCD10)2,3,4 ,5,6. Questi geni sono presenti in un unico complesso di segnalazione.
Vari modelli sono stati sviluppati per malattia umana di CCM modello e capire le vie a valle dei geni CCM che sono responsabili per CCM7,8,9,10. Il modello più robusto è condizionalmente eliminare uno qualsiasi dei geni Ccm con tamoxifene-inducibile Cdh5-CreERT2 P1 in cuccioli appena nati8,10. Questi cuccioli sviluppano lesioni CCM nel cervello da P6 in avanti e si pensano che siano un modello ideale per studi pre-clinici nella ricerca dei meccanismi e agenti terapeutici nel trattamento delle malattie CCM.
Carico lesionale CCM nel cervello del topo è stato misurato principalmente di metodi basati su istologia, un approccio che è estremamente che richiede tempo e soggetto a investigatore bias10,11,12. Metodi di base di MRI sono stati utilizzati per valutare il carico lesionale CCM nel topo adulto modello9,13. Tuttavia, per raggiungere una soluzione soddisfacente per l'identificazione delle lesioni CCM è necessaria un strumento MRI piccolo altamente specializzato animale e lunghi tempi di scansione di diverse ore per una notte. Inoltre, se MRI può essere utilizzato per rilevare le lesioni CCM in topi neonatali non è stato segnalato e risoluzione può limitare la sensibilità.
Recentemente abbiamo sviluppato una tecnica di micro-CT per immagine e analizzare CCM lesione14,15. Questo ad alta risoluzione, tempo e conveniente metodo drammaticamente incrementato il valore del modello di malattia CCM in studi meccanicistici e terapeutici. Metodi di colorazione del Monte dimiglioramento, tutta sono stati utilizzati per micro-CT imaging di tessuti molli e del mouse embrioni16,17. In precedenza, abbiamo usato una base di osmio macchiatura per aumentare il contrasto per micro-CT imaging delle lesioni CCM in cervello14. In questa carta, abbiamo usato meno tossico, non-distruttivo, e costo-efficiente reagente, un iodio basato soluzione di Lugol, per migliorare il contrasto per imaging di micro-CT. Lo iodio può diffondersi in tutto il cervello e ha un'alta affinità per sangue18.
Il protocollo dettagliato è presentato qui per l'induzione delle lesioni CCM in un modello murino neonatale con l'imaging e l'analisi delle lesioni CCM con micro-CT di contrasto-basato. Questo metodo di base di micro-CT fornisce una misura quantitativa globale del volume della lesione CCM, individua con precisione il numero e la posizione 3D di CCM lesioni nel cervello del topo e riduce notevolmente il costo e il tempo necessario per il fenotipo di questi animali.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >4-hydroxy tamoxifen</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H6278</td>
			<td >To activate Cdh5-CreErt2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corn oil</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8267-500ML</td>
			<td >To dilute 4-hydroxy tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M205FA</td>
			<td >To take macroscopic images</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lugol&#39;s Iodine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L6146</td>
			<td >To stain samples for contrast micro-CT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic paraffin film</td>
			<td >Parafilm</td>
			<td >PM992</td>
			<td >To package samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro-CT</td>
			<td >Xradia</td>
			<td >MicroXCT-400</td>
			<td >Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D rendering software</td>
			<td >FEI Visualization Science group</td>
			<td >Avizo 3D image processing software</td>
			<td >To analyse micro-CT scans</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and micro-ct imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model

Mutazioni nella CCM1 (aka KRIT1), CCM2, o CCM3 (aka PDCD10) gene causano malformazione cavernosa cerebrale (CCM) in esseri umani. Modelli murini di malattia CCM sono stati stabiliti da tamoxifene indotto da delezione dei geni Ccm in animali postnatali. Questi modelli di mouse forniscono preziosi strumenti per studiare il meccanismo molecolare e approcci terapeutici per la malattia CCM. Un metodo preciso e quantitativo per valutare la progressione e carico lesionale è essenziale per sfruttare il valore completo di questi modelli animali. Qui, dimostriamo l'induzione di malattia in un modello murino di CCM e l'uso del contrasto migliorato il metodo di (micro-CT) micro tomografia computerizzata a raggi x per misura CCM carico lesionale in cervelli di topo. Al giorno postnatale 1 (P1), abbiamo usato 4-hydroxytamoxifen (4HT) per attivare Cre ricombinasi attività dal transgene fendere floxed allele del Ccm2Cdh5-CreErt2. Le lesioni CCM in cervelli di topo sono state analizzate P8. Per micro-CT, soluzione di Lugol iodio basato è stato usato per migliorare il contrasto nel tessuto cerebrale. Abbiamo ottimizzato i parametri di scansione e utilizzate una dimensione del voxel di 9,5 µm, che conducono a una dimensione minima caratteristica di circa 25 µm. Questa risoluzione è sufficiente per misurare il numero e volume della lesione CCM a livello globale e con precisione e fornire alta qualità 3D mapping delle lesioni CCM in cervelli di topo. Questo metodo migliora il valore dei modelli del mouse stabilite per studiare le basi molecolari e le terapie potenziali per CCM e altre malattie cerebrovascolari.

Una singola iniezione di 4HT P1 era sufficiente per indurre le lesioni CCM nel cervelletto. Lugol iodio contrastato micro-CT sufficientemente rilevato lesioni CCM e potrebbe quantificare il volume e il numero. Utilizzando il micro-CT ottimizzato, abbiamo ripreso lesioni CCM in hindbrains di topi Ccm2iECKO . Immagini digitalizzate di raggi x sono stati ricostruiti per produrre immagini 3D del cervello del mouse, che ha permesso la visualizzazione delle lesioni intere n...

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Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Questo protocollo dimostra l'induzione della malattia di malformazione cavernosa cerebrale in un modello murino e usi contrasto migliorato micro tomografia computerizzata per misurare il carico lesionale. Questo metodo aumenta il valore di modelli murini stabilito per lo studio delle basi molecolari e le terapie potenziali per malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.

Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

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