Name: live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Ringraziamo Michael VanNieuwenhze (Indiana University) per il dono della FDAAs utilizzato nella Figura 2 e Figura 4. Ringraziamo i membri del lab marrone per feedback durante la preparazione di questo manoscritto. Ricerca in laboratorio marrone sulla divisione e crescita delle cellule di a. tumefaciens è supportato dalla National Science Foundation (IOS1557806).

1. crescita di ceppi di a. tumefaciens
<ol><li>
Coltura a. tumefaciens ceppi
	<ol>
<li>Usare una punta in legno sterile di bastone o una pipetta per inoculare 1 mL di coltura ATGN (Vedi la lista dei materiali per la ricetta) con una singola Colonia del ceppo desiderato. Nota: Per i ceppi di svuotamento di a. tumefaciens , il ATGN deve contenere 1 mM IPTG come induttore per mantenere la biosintesi della proteina essenziale.</li>
		<li>Crescere i ceppi di a. tumefaciens<...

Questo protocollo contiene una serie di procedure per l'indagine dei ceppi di a. tumefaciens wildtype, mutante e svuotamento. Vale la pena notare che tutte le procedure elencate nella sezione protocollo può essere facilmente adattate per altri ceppi batterici con ulteriori modifiche per tenere conto per crescita media, temperature e tassi di crescita.
L'uso di coloranti specifici per la destinazione è uno strumento prezioso per fornire una caratterizzazione dettagliata degli eventi ...

Progressione attraverso il ciclo cellulare batterica richiede il coordinamento di molti processi tra cui biosintesi membrana e parete cellulare, replicazione del DNA e la segregazione e la divisione cellulare. Per comprendere appieno la complessità della biologia della cellula batterica, è necessario studiare questi eventi essenziali; Tuttavia, questo è un compito banale, poiché la vitalità cellulare è compromessa quando componenti chiave di queste vie sono mutagenizzati. Epifluorescenza accoppiato con coloranti specifici per la destinazione è un approccio potente per sondare questi processi essenziali in wildtype e ceppi batterici mutanti.
Peptidoglicano specifici coloranti sono fluorescenti antibiotici (vancomicina-FL, bocillin-FL) e fluorescenti-ammino acidi (ad esempio, 7-hydroxycoumarin-3-carbossilico acido 3-ammino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetrametilrodamina-3-ammino-d-alanina; TADA). Nei batteri Gram-positivi, l'uso di concentrazioni subletali di antibiotici fluorescente analoghi ai siti della biosintesi del peptidoglicano della sonda è stato una strategia efficace per rivelare peptidoglicano inserimento modelli1,2, 3,4. Mentre etichettatura fluorescente vancomicina è stato utilizzato per acquisire conoscenze nel peptidoglicano modelli di inserimento nei batteri gram-negativi fisso5, la membrana esterna generalmente fornisce una barriera di permeabilità che impedisce l'utilizzo di fluorescente antibiotici come una sonda per la biosintesi del peptidoglicano in cellule vive. Al contrario, brevi impulsi di fluorescente-d-amminoacidi o d-amminoacidi con gruppi funzionali biortogonali etichetta covalentemente regioni di recente inserimento di peptidoglicano in una vasta gamma di vita cellule batteriche6,7. Modelli di inserimento di peptidoglicano che sono stati osservati con d-amminoacidi sintetici includono punctate e settale (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e settale (Agrobacterium tumefaciens e Monocytogenes di Listeria), unico settale (Staphylococcus aureus) e apicale (Streptomyces venezuelae)6,7. Queste osservazioni indicano che i batteri presentano diversi modelli di biogenesi della parete cellulare e che l'uso degli acidi d-amminoacido sintetici come sonde per l'esame di patterning di crescita è una strategia importante in molti batteri.
Coloranti che etichettano cromosomi batterici comprendono il legante specifico solco minore di acido desossiribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e ad alta affinità cianina coloranti (verde e arancione; vedere elenco dei materiali). DAPI macchiatura delle celle fisse assiste nell'enumerazione dei batteri da campioni ambientali8, mentre DAPI macchiatura delle celle in tensione viene utilizzata per indicare la vitalità batterica9. Al contrario, la cianina coloranti come arancione e verde sono spesso descritti come cellule "morte" impermeant membrana le macchie per enumerare le cellule non vitali9. Notevolmente, quando questi reattivi sono utilizzati per sondare la morfologia del nucleoide batterico durante la crescita delle cellule, DAPI, arancione e verde erano tutti indicati per essere membrana permeante e capace di etichettatura cellule vive10. In e. coli cellule vive, DAPI macchiatura del DNA appare diffusa a causa di auto-fluorescenza dal citoplasma ed esposizioni ripetute delle cellule DAPI-macchiato ai raggi ultravioletti (UV) perturba il nucleoide struttura10. Colorazione e. coli o Bacillus subtilis con Orange rivela che questa tintura è membrana permeante e fornisce lunga durata fluorescenza legandosi al DNA in cellule vive senza influire sulla crescita cellulare, replicazione del DNA o segregazione del cromosoma10 . Queste osservazioni suggeriscono che cianina DNA coloranti possono essere utilizzati per monitorare la morfologia del nucleoids durante la crescita delle cellule in molti batteri.
Phospholipid-specific stryl coloranti quali N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro di pyridinium (4-64; veda lista materiali) sono composti cationici e associare preferenzialmente con carica negativa fosfolipidi come la cardiolipina e fosfatidilglicerolo11. Modelli distinti sono osservate quando 4-64 è usato per etichettare la membrana di batteri diversi. In Escherichia coli, 4-64 si arricchisce nei poli, nelle bande lungo la parete laterale e nei siti di divisione di ritardo pre-divisional cellule12. In Bacillus subtilis, 4-64 etichettatura consente la visualizzazione di lipido spirali13. In Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etichette la membrana esterna e si osserva in un modello caratteristico "ferro di cavallo" in cui il Polo di crescita è privo di etichettatura14,15. Queste osservazioni indicano che questi batteri presentano distribuzioni eterogenee dei lipidi a causa della presenza di domini lipidici che contribuiscono alla asimmetria cellulare. Cambiamenti nei modelli di etichettatura 4-64 come la presenza di etichettatura diffusa, vescichette o vescicole, i invaginations o restringimento della membrana può essere informativo nella caratterizzazione dei mutanti che influenzano la distribuzione o la biosintesi dei lipidi.
Limita macchiatura delle celle, determinare la funzione delle proteine che partecipano a processi essenziali è necessario. La caratterizzazione delle proteine essenziali è tecnicamente impegnativa perché non è possibile eliminare geni essenziali e studiare le conseguenze fenotipiche. Così, sono emersi approcci alternativi che riducono la proteina. Ad esempio, un gene essenziale può essere messo sotto il controllo di un promotore inducibile anziché suo promotore nativo. Promotori inducibili sono sensibli a reagire a piccole molecole come; 16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosio22, Vanillato17,23, di zinco e xilosio23, così la trascrizione del gene target cessa e la proteina di interesse è esaurita quando l'induttore viene rimosso. Approcci alternativi per esaurire le proteine essenziali di interesse includono riboswitches sintetico24 che utilizzare interazioni di piccola molecola-RNA per ostacolare la trascrizione di geni bersaglio, CRISPR interferenza25,26 blocco la trascrizione di geni bersaglio e proteina viscoelastica degradazione27,28 , che utilizza i tag di peptide proteine bersaglio per degradazione dalla proteasi ClpXP. Ceppi di svuotamento forniscono solo un breve periodo per caratterizzazione prima le cellule perdono vitalità, di conseguenza, la formazione immagine microscopica delle cellule nel tempo durante lo svuotamento della proteina è un approccio potente per caratterizzazione. Infatti, microscopia di cellule batteriche viventi ha permesso ai ricercatori di acquisire conoscenze in processi biologici fondamentali, compresi i meccanismi di mantenimento di forma delle cellule, secrezione e compartimentalizzazione29.
A. tumefaciens è un impianto batterico patogeno30 e ingegnere genetico naturale31,32. Così, tra cui meccanismi correlati alla patogenicità, ospite-patogeno interazioni33,34,35, secrezione36e host trasformazione30,31, 37 sono stati studiati. Per progettare strategie che prevenire le malattie a. tumefaciens mediata o migliorare impianto trasformazione, è necessario comprendere meglio i processi essenziali per la sopravvivenza di a. tumefaciens . L'uso di coloranti specifici per la destinazione e il recente sviluppo di una strategia di svuotamento della proteina per a. tumefaciens18 fornisce un mezzo per indagare i processi essenziali.
Qui, protocolli dettagliati per l'analisi al microscopio dei ceppi di svuotamento wildtype, mutante e proteina di a. tumefaciens sono forniti. I primi due protocolli descrivono come preparare cellule ed etichettarli con coloranti specifici per la destinazione. Il terzo protocollo vengono fornite istruzioni dettagliate per la preparazione dell'agarosi pastiglie (Figura 1) e imaging le cellule batteriche (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Questi protocolli possono anche essere adatti per altri batteri con ulteriori adattamenti per tenere conto per media differenti condizioni, tassi di crescita, fabbisogno di ossigeno e strutture cellulari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33970</td>
			<td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58&#916;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA &#916;ctrA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATGN Minimal Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &#176;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4&#8226;7H2O, 0.2 g/L CaCl2&#8226;2H2O, and 0.024 g/L MnSO4&#8226;H2O to water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4&#8226;H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16</td>
			<td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional Media Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>K-120</td>
			<td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550D</td>
			<td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle Glass Cleaner</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>203261385</td>
			<td>Ammonia and alcohol free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-999</td>
			<td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &#176;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin Butter</td>
			<td>SAAQIN</td>
			<td>SQ-LAB-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Target Corp.</td>
			<td>06-17644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Crafty Candles</td>
			<td>263012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target-specific dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11368</td>
			<td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td>
			<td>52120-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic thermal beads</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>42370-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Processi cellulari di base come replicazione del DNA e segregazione, sintesi proteica, biosintesi della parete cellulare e divisione cellulare si affidano la funzione delle proteine che sono essenziali per la sopravvivenza batterica. Una serie di coloranti specifici per la destinazione può essere utilizzata come sonde per meglio comprendere questi processi. Colorazione con coloranti lipofilici permette l'osservazione della struttura della membrana, visualizzazione di microdomini lipidici e la rilevazione delle vescichette di membrana. Utilizzo di fluorescente-d-amminoacidi (FDAAs) per sondare i siti della biosintesi del peptidoglicano possa indicare potenziali difetti nella biogenesi della parete cellulare o il modello di crescita delle cellule. Infine, le macchie di acido nucleico possono indicare eventuali difetti nella segregazione del cromosoma o replica di DNA. Cianina DNA macchie etichetta cellule viventi e sono adatto per microscopia time-lapse consentendo osservazioni in tempo reale della morfologia nucleoide durante la crescita delle cellule. Protocolli per l'etichettatura di cella possono essere applicati ai mutanti di deplezione di proteine per identificare i difetti nella struttura della membrana, biogenesi della parete cellulare o segregazione del cromosoma. Inoltre, microscopia time-lapse può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti morfologici come una proteina essenziale viene rimosso e può fornire ulteriori approfondimenti in funzione della proteina. Ad esempio, l'esaurimento delle proteine essenziali divisione cellulare provoca filamentazione o diramazione, considerando che l'esaurimento delle proteine della crescita delle cellule può causare le cellule a diventare più brevi o più rotondo. Qui, protocolli per la crescita delle cellule, l'etichettatura specifica della destinazione e microscopia time-lapse sono forniti per l'agente patogeno batterico pianta Agrobacterium tumefaciens. Insieme, target-specifici coloranti e time-lapse microscopia consentono la caratterizzazione dei processi essenziali in a. tumefaciens. Infine, i protocolli forniti possono essere facilmente modificati per sondare i processi essenziali in altri batteri.

Target-specifici di etichettatura di wildtype A. tumefaciens cellule Per illustrare che la morfologia delle cellule non è influenzato dal trattamento con 1% DMSO (che viene utilizzato per diluire i coloranti fluorescenti) o fasi di lavaggio, le cellule erano imaged direttamente dalla cultura (Figura 2A, pannello di estrema sinistra), dopo aver lavato le cellule di centrifugazione, come descritto...

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Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

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