Name: live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00
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Agradecemos o dom dos FDAAs usado na Figura 2 e Figura 4-Michael VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Agradecemos a membros do laboratório marrom para feedback durante a preparação deste manuscrito. Pesquisa no laboratório de marrom na divisão e crescimento de células da . tumefaciens é suportada pela National Science Foundation (IOS1557806).

1. crescimento de cepas da . tumefaciens
<ol><li>
Cultivo de cepas da . tumefaciens
	<ol>
<li>Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada. Nota: Para as estirpes de depleção da . tumefaciens , o ATGN deve conter 1 mM IPTG como um indutor para manter a biossíntese da proteína essencial.</li>
		<li>Crescem as cepas da . tumefacien...

Este protocolo contém uma série de procedimentos para a investigação de cepas da . tumefaciens sua, mutante e esgotamento. É interessante notar que todos os procedimentos listados na seção de protocolo podem ser facilmente adaptados para outras cepas bacterianas com modificações adicionais para dar conta de mídia de crescimento, temperaturas e taxas de crescimento.
O uso de corantes de destino específico é uma ferramenta valiosa para fornecer uma caracterização detalhada...

Progressão através do ciclo celular bacteriano requer a coordenação de muitos processos, incluindo a biossíntese de membrana e parede celular, replicação do DNA e segregação e divisão celular. Para compreender a complexidade da biologia da célula bacteriana, é necessário estudar esses eventos essenciais; no entanto, essa é uma tarefa não trivial desde a viabilidade celular fica comprometida quando componentes-chave destas vias são mutagenized. Microscopia de epifluorescência juntamente com corantes de destino específico é uma poderosa abordagem para investigar estes processos essenciais em sua e estirpes de bactérias mutantes.
Corantes de peptidoglicano específicos incluem fluorescente-d-amino ácidos (por exemplo, 7-Hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina e fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) , NADA; diversos-3-amino-d-alanina; TADA). Em bactérias gram-positivas, o uso de concentrações subletais de análogos de antibióticos fluorescentes para sondar sites da biossíntese do peptidoglicano tem sido uma estratégia eficaz para revelar o peptidoglicano inserção padrões1,2, 3,4. Enquanto rotulagem fluorescente vancomicina tem sido usada para obter insights sobre o peptidoglicano padrões de inserção em bactérias Gram-negativas fixa5, a membrana externa geralmente fornece uma barreira de permeabilidade que impede o uso de fluorescentes antibióticos como uma sonda para a biossíntese do peptidoglicano em células vivas. Em contraste, pulsos de fluorescente-d-amino ácidos ou d-amino ácidos com grupos funcionais de biorthogonal covalentemente rotulam regiões de inserção de peptidoglicano recentes em uma ampla gama de vida células bacterianas6,7. Padrões de inserção de peptidoglicano que têm sido observados com d-aminoácidos sintéticos incluem punctate e septal (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e septal (Agrobacterium tumefaciens e Listeria monocytogenes), único do septo (Staphylococcus aureus) e apical (Streptomyces venezuelae)6,7. Estas observações indicam que as bactérias apresentam diversos padrões de biogênese de parede celular e que o uso de ácidos d-aminoácido sintéticos como sondas para examinar a padronização de crescimento é uma estratégia valiosa em muitas bactérias.
Corantes que rotulam cromossomos bacterianos incluem o fichário de sulco menor específicas do Ácido desoxirribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e corantes de cianina de alta afinidade (verde e laranja; consulte a lista de materiais). DAPI coloração de células fixas auxilia na enumeração de bactérias a partir de amostras ambientais8, Considerando que a DAPI coloração de células vivas é usada para indicar a viabilidade bacteriana9. Em contraste, cianina corantes tais como laranja e verde são frequentemente descritos como manchas de célula "morto" impermeant de membrana para enumerar as células não-viáveis9. Notavelmente, quando estes reagentes são usados para sondar a morfologia de nucleoide bacteriana durante o crescimento celular, DAPI, laranja e verde foram todos mostrado membrana permeant e capaz de rotulagem de células vivas10. Em células de Escherichia coli vivas, DAPI coloração de DNA aparece difusa devido a autofluorescência de citoplasma e repetidas exposições de células manchadas de DAPI à luz ultravioleta (UV) perturba o nucleoide estrutura10. Coloração de e. coli ou b. subtilis com laranja revela que este corante é membrana permeant e fornece fluorescência de longa duração com ligação ao DNA em células vivas, sem afetar o crescimento da pilha, o replication do DNA ou segregação do cromossomo10 . Estas observações sugerem que cyanine tinturas de DNA podem ser usadas para monitorar a morfologia da nucleoids durante o crescimento celular de muitas bactérias.
Phospholipid-specific stryl corantes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibrometo de piridínio (4-64; consulte a lista de materiais) são compostos catiônicos e associar preferencialmente com carga negativa fosfolípidos como cardiolipina e fosfatidilglicerol11. Padrões distintos são observados quando 4-64 é usado para rotular a membrana de bactérias diferentes. Em Escherichia coli, 4-64 é enriquecido nos polos, em faixas ao longo da parede lateral e nos sites de divisão de tarde pre-divisional células12. Em Bacillus subtilis, 4-64 rotulagem permite a visualização de lipídios espirais13. Em Agrobacterium tumefaciens, 4-64 rotula a membrana externa e é observado em um padrão característico "ferradura" no qual o polo de crescimento é desprovido de rotulagem de14,15. Estas observações indicam que essas bactérias apresentam distribuições de lipídios heterogênea devido à presença de domínios de lipídios que contribuem para a assimetria celular. Mudanças nos padrões de rotulagem 4-64 como a presença de rotulagem difusa, bolhas ou vesículas, invaginações ou encolhimento de membrana pode ser informativo em caracterizando mutantes que impactam a distribuição ou a biossíntese de lipídios.
Além da coloração de células, é necessário determinar a função das proteínas que participam em processos essenciais. A caracterização das proteínas essenciais é tecnicamente desafiador, porque não é possível excluir genes essenciais e estudar as consequências fenotípicas. Assim, surgiram a abordagens alternativas que empobrecem a proteína. Por exemplo, um gene essencial pode ser colocado sob o controle de um promotor inducible, ao invés de seu promotor nativo. Promotores inducible são sensíveis a pequenas moléculas, tais como; 16, isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, de zinco e xilose23, assim, a transcrição do gene alvo cessa e a proteína de interesse é empobrecida quando o indutor é removido. Abordagens alternativas para esgotar as proteínas essenciais de interesse incluem riboswitches sintético24 que utilizam interações pequena molécula-RNA para dificultar a transcrição dos genes-alvo, CRISPR interferência25,26 para bloco de transcrição dos genes-alvo e Proteína inducible degradação27,28 que usa etiquetas de peptídeos de proteínas alvo para degradação pela ClpXP protease. Cepas de depleção fornecem apenas um curto período de tempo para caracterização antes que as células perdem a viabilidade, portanto, imagens microscópicas de células ao longo do tempo durante a depleção de proteína é uma poderosa abordagem para caracterização. Com efeito, microscopia das células bacterianas vivas permitiu aos pesquisadores obter insights sobre os processos biológicos fundamentais, incluindo os mecanismos de manutenção de forma celular, secreção e compartimentalização29.
A. tumefaciens é uma planta bacteriana patógeno30 e natural engenheiro genético31,32. Assim, os mecanismos relacionados a patogenicidade, incluindo3534,33,do interações patógeno-hospedeiro, secreção36e anfitrião transformação30,31, 37 tem sido extensivamente investigada. Para a concepção de estratégias que impedem a. tumefaciens mediada por doença ou reforçar a transformação da planta, os processos essenciais para a sobrevivência da . tumefaciens precisam ser melhor compreendida. O uso de corantes de destino específico e o recente desenvolvimento de uma estratégia de depleção de proteína pela . tumefaciens18 fornece um meio para investigar os processos essenciais.
Aqui, protocolos detalhados para análise microscópica de cepas de depleção de proteína, mutante e sua da . tumefaciens são fornecidos. Os dois primeiros protocolos descrevem como preparar células e rotulá-los com corantes de destino específico. O terceiro Protocolo fornece instruções passo a passo para preparar pastilhas de agarose (Figura 1) e imagem latente as células bacterianas (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Esses protocolos também podem ser adequados para outras bactérias com adaptações adicionais para condições de diferentes mídias, taxas de crescimento, exigências de oxigênio e estruturas celulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33970</td>
			<td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58&#916;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA &#916;ctrA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATGN Minimal Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &#176;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4&#8226;7H2O, 0.2 g/L CaCl2&#8226;2H2O, and 0.024 g/L MnSO4&#8226;H2O to water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4&#8226;H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16</td>
			<td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional Media Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>K-120</td>
			<td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550D</td>
			<td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle Glass Cleaner</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>203261385</td>
			<td>Ammonia and alcohol free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-999</td>
			<td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &#176;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin Butter</td>
			<td>SAAQIN</td>
			<td>SQ-LAB-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Target Corp.</td>
			<td>06-17644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Crafty Candles</td>
			<td>263012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target-specific dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11368</td>
			<td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td>
			<td>52120-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic thermal beads</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>42370-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Principais processos celulares tais como a replicação do DNA e segregação, síntese proteica, biossíntese da parede celular e divisão celular dependem a função das proteínas que são essenciais para a sobrevivência bacteriana. Uma série de corantes de destino específico pode ser usada como sondas para melhor compreender estes processos. Coloração com corantes lipofílicos permite a observação da estrutura da membrana, visualização de lipídios microdomains e detecção de bolhas de membrana. Uso de fluorescentes-d-amino ácidos (FDAAs) para sondar os locais da biossíntese do peptidoglicano pode indicar potenciais defeitos na parede celular biogênese ou padronização do crescimento celular. Finalmente, as manchas de ácidos nucleicos podem indicar possíveis defeitos na segregação de replicação ou cromossomo de DNA. Cianina DNA manchas rótulo células vivas e são adequado para microscopia de lapso de tempo permitindo observações em tempo real de morfologia nucleoide durante o crescimento celular. Protocolos para a rotulagem de célula podem ser aplicados para os mutantes de depleção de proteína para identificar defeitos na estrutura da membrana, parede celular biogênese ou segregação do cromossomo. Além disso, a microscopia de lapso de tempo pode ser usada para monitorar alterações morfológicas como uma proteína essencial é removida e pode fornecer insights adicionais em função da proteína. Por exemplo, o esgotamento das proteínas essenciais a divisão celular resulta em filamentação ou ramificação, Considerando que a depleção das proteínas de crescimento celular pode causar células tornar-se mais curtos ou mais redondo. Aqui, os protocolos para crescimento celular, destino-específico marcação e microscopia de lapso de tempo são fornecidos para o patógeno bacteriano planta Agrobacterium tumefaciens. Juntos, alvos tintas e microscopia de lapso de tempo permitem a caracterização de processos essenciais em a. tumefaciens. Finalmente, os protocolos fornecidos podem ser facilmente modificados para sondar os processos essenciais em outras bactérias.

Destino-específico marcação de sua A. tumefaciens células A fim de ilustrar essa morfologia celular não é afetada pelas etapas de lavagem ou tratamento com 1% de DMSO (que é usada para diluir os corantes fluorescentes), as células foram fotografadas diretamente da cultura (Figura 2A, painel de extrema-esquerdo), depois de lavar as células por centrifugação conforme descrito no ponto 1....

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Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

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