Name: live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Мы благодарим Майкла VanNieuwenhze (Университет Индианы) за дар FDAAs, используемые в рисунке 2 и на рисунке 4. Мы благодарим членов коричневый лаборатории для обратной связи в ходе подготовки этой рукописи. Исследования в коричневый лаборатории на деление и рост клеток A. tumefaciens поддерживается Национальный научный фонд (IOS1557806).

1. рост A. tumefaciens штаммов
<ol><li>
Культивирования штаммов A. tumefaciens
	<ol>
<li>Используйте стерильные деревянные палки или пипетки подсказка для инокуляции 1 мл с одной колонии штамма желаемого ATGN роста средств массовой информации (см. перечень материалов для рецепта). Примеч?...

Этот протокол содержит ряд процедур для расследования случаев A. tumefaciens wildtype, мутант и истощение штаммов. Стоит отметить, что все процедуры, перечисленные в разделе Протокол может быть легко адаптирована для других бактериальных штаммов с дополнительными изменениями для учета рос?...

Прогрессии через бактериальный клеточный цикл требует координации многих процессов, включая мембраны и клеточной стенки биосинтез, репликации ДНК и сегрегации и деление клеток. Чтобы полностью понять сложность биологии бактериальной клетки, необходимым для изучения этих основных событий; Однако это нетривиальная задача, поскольку жизнеспособность клеток нарушается, когда mutagenized ключевых компонентов этих путей. В сочетании с целевыми красители микроскопия помощью эпифлуоресцентного представляет собой мощный подход к зонд эти основные процессы в wildtype и мутантных штаммов бактерий.
Мукопептида конкретных красители включают люминесцентные антибиотики (ванкомицин FL, bocillin-FL) и люминесцентные d-аминокислоты (например, 7-hydroxycoumarin-3-карбоновых кислот-3-амино d аланина, ХАДА; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d аланина , НАДА; тетраметилродамина-3-амино d аланина; ТАДА). В грам-положительных бактерий использование сублетальные концентрации флуоресцентные антибиотик аналогов зонда сайты биосинтез мукопептида была эффективная стратегия раскрыть мукопептида вставки шаблоны1,2, 3,4. Хотя флуоресцентные ванкомицин маркировки был использован для получения понимание мукопептида вставки шаблоны в5фиксированных грамотрицательных бактерий, внешней мембраны обычно обеспечивает проницаемость барьер, который предотвращает использование люминесцентные антибиотики, как зонд для биосинтез мукопептида в живых клетках. В отличие от коротких импульсов люминесцентные d-аминокислоты или d-аминокислоты с биортогональный функциональных групп ковалентно ярлык регионах недавние мукопептида вставки в широкий спектр живых бактериальных клеток6,7. Шаблоны мукопептида вставки, которые были отмечены с синтетическими d-аминокислоты включают пунктата и межжелудочковой перегородки (кишечная палочка и Сенная палочка), полярных и межжелудочковой перегородки (Agrobacterium tumefaciens и Листерий), только межжелудочковой перегородки (Staphylococcus aureus) и верхушечно (Streptomyces venezuelae)6,7. Эти наблюдения показывают, что бактерии проявляют разнообразных моделей биогенеза клеточной стенки, и что использование синтетических d-аминокислоты как зонды для изучения роста патронирования ценные стратегии многих бактерий.
Красители, которые ярлык бактериальной хромосомы включают связывателя конкретные мелкие канавки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) и высоким сродством цианиновые красители (зеленый и оранжевый; список материалов). DAPI пятнать фиксированных ячеек помогает в перечислении бактерий из8проб окружающей среды, тогда как DAPI пятнать живых клеток используется для обозначения бактериальных жизнеспособности9. В отличие от цианиновые красители, такие, как оранжевый и зеленый часто описывается как impermeant «мертвых» клеток мембрана пятна для перечисления нежизнеспособных клеток9. Замечательно когда эти реагенты используются для зонда морфология бактериальный nucleoid во время роста клеток, DAPI, оранжевый и зеленый были все показано мембраны permeant и способных маркировки живых клеток10. В клетках E. coli живут, DAPI окрашивание ДНК появляется диффузных благодаря auto флуоресценции от цитоплазмы и повторные воздействия ультрафиолетового (УФ) света DAPI-окрашенных клеток возмущает структуры nucleoid10. Окрашивание E. coli или B. subtilis с оранжевый показывает, что эта краска является мембрана permeant и обеспечивает длительное флуоресценции после привязки к ДНК в живых клетках без влияния на рост клеток, репликация ДНК или хромосомы сегрегации10 . Эти наблюдения предполагают, что цианиновые красители ДНК может использоваться для мониторинга морфология нуклеоидах во время роста клеток в многих бактерий.
Phospholipid-specific stryl красителей, таких как N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) фенил) hexatrienyl) пиридиния дибромид (4-64; см. перечень материалов) Катионный соединений и связывается преимущественно отрицательно заряженные фосфолипиды например cardiolipin и фосфатидилглицерина11. Различные шаблоны наблюдаются при 4-64 используется для обозначения мембраны различных бактерий. В Escherichia coli4-64 обогащается в полюсах, в группах вдоль боковых стен и в конце pre-divisional сайтов отдела12клеток. Сенная палочка4-64 маркировки позволяет визуализацию липидов спирали13. В Agrobacterium tumefaciens4-64 этикетки внешней мембраны и наблюдается в шаблоне характерный «подкова», в котором полюса роста является лишен Этикетировочный14,15. Эти наблюдения показывают, что эти бактерии проявляют распределения гетерогенных липидов вследствие наличия липидных доменов, которые способствуют сотовой асимметрии. Изменения в 4-64 маркировки шаблонов, таких как наличие диффузного маркировки, раковины или везикулы, кариолеммы или мембраны усадка может быть информативным в характеристике мутантов, которые влияют на распространение или биосинтеза липидов.
Помимо окрашивания клеток, определения функции белков, участвующих в основных процессах является необходимым. Характеристика основных белков технически сложным, потому что это не возможно удалить важно генов и изучить фенотипические последствия. Таким образом появились альтернативные подходы, которые разрушают белки. Например важно генов может поставить под контролем индуцибельной промоутер, вместо того, чтобы его родной промоутер. Индуцибельной промоутеров реагировать малых молекул, таких как; цинка16, изопропиловый β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG)17,18,19,20,21, Арабиноза22,23vanillate17,, Ксилоза23, таким образом перестает транскрипции гена целевой и протеина интереса истощается при удалении индуктором. Альтернативные подходы для разрушающих эфироносных протеинов интереса включают синтетические riboswitches24 , которые используют малые молекулы РНК взаимодействия мешают транскрипции генов-мишеней, ТРИФОСФАТЫ вмешательства25,26 для блока транскрипции генов-мишеней, и протеин индуцибильный деградации27,28 , который использует пептид теги для белков-мишеней для деградации ClpXP протеазы. Истощение штаммов обеспечивают лишь на короткое время для характеризации, прежде чем клетки теряют жизнеспособность, поэтому, микроскопических изображений с течением времени во время белковых истощения клеток мощный подход для определения характеристик. Действительно микроскопия живых бактериальных клеток позволило исследователям получить понимание основных биологических процессов, включая механизмы клеток форму обслуживания, секреции и дробления29.
A. tumefaciens — возбудитель бактериальной растений30 и естественный генетический инженер31,32. Таким образом, механизмы, связанные с патогенностью, включая хост возбудитель взаимодействия33,34,35, секрецию36и принимающих преобразования30,31, 37 широко исследованы. Для разработки стратегий, которые предотвращают A. tumefaciens опосредованной болезни или расширить завод преобразования, процессов, необходимых для выживания A. tumefaciens необходимо лучше понимать. Использование целевых красителей и последние разработки стратегии истощения белка для A. tumefaciens18 предоставляет средства для изучения основных процессов.
Здесь предоставляются подробные протоколы для микроскопического анализа wildtype, мутанты и белка истощения штаммов A. tumefaciens . Первые два протокола описывается, как подготовить клетки и маркировать их с целевыми красители. Третий протокол содержит пошаговые инструкции для подготовки агарозы прокладки (рис. 1) и визуализации бактериальной клетки (Рисунок 2, Рисунок 3, , рис. 4). Эти протоколы также могут быть пригодны для других бактерий с дополнительных приспособлений для учета различных средств массовой информации условия, темпы роста, кислороде и клеточных структур.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33970</td>
			<td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens C58&#916;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA &#916;ctrA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATGN Minimal Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &#176;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X AT Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4&#8226;7H2O, 0.2 g/L CaCl2&#8226;2H2O, and 0.024 g/L MnSO4&#8226;H2O to water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4&#8226;H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16</td>
			<td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional Media Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>K-120</td>
			<td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550D</td>
			<td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle Glass Cleaner</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>203261385</td>
			<td>Ammonia and alcohol free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399500</td>
			<td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-999</td>
			<td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &#176;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin Butter</td>
			<td>SAAQIN</td>
			<td>SQ-LAB-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Target Corp.</td>
			<td>06-17644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Crafty Candles</td>
			<td>263012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target-specific dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11368</td>
			<td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td>
			<td>52120-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic thermal beads</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>42370-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Основные клеточные процессы такие как репликации ДНК и сегрегации, синтез белков, биосинтез клеточной стенки и деление клеток полагаются на функции белков, которые имеют важное значение для выживания бактерий. Серия красители для конкретных целевых объектов может использоваться как зонды для лучшего понимания этих процессов. Окрашивание с помощью липофильных красителей позволяет наблюдение мембранные структуры, Визуализация microdomains липидов и обнаружение шелесту мембраны. Использование флуоресцентных d-аминокислоты (FDAAs) для проверки сайтов биосинтез мукопептида может указывать на потенциальные дефекты в клеточной стенки биогенеза или патронирования рост клеток. Наконец пятен нуклеиновой кислоты могут указать возможные дефекты в ДНК хромосомы или репликация сегрегации. Цианиновые ДНК пятна лейбл живых клеток и подходят для покадровой микроскопии позволяет в реальном времени наблюдения nucleoid морфологии во время роста клеток. Протоколы для маркировки клеток может применяться для истощения мутанты белка для выявления дефектов в структуре мембраны, клеточной стенки биогенеза или хромосома сегрегации. Кроме того покадровой микроскопии может использоваться для мониторинга морфологические изменения как необходимый белок удаляется и может обеспечить дополнительное понимание функции протеина. Например истощение важнейших деление клеток белков приводит к филаментацию или ветвления, тогда как истощение белков рост клеток может привести к клетки, чтобы стать короче или круглее. Здесь протоколы для роста клеток, целевой объект специфического маркировки и time-lapse микроскопии предусмотрены возбудителя бактериального завод Agrobacterium tumefaciens. Вместе, целевой объект специфического красители и time-lapse микроскопии дать характеристику основных процессов в A. tumefaciens. Наконец протоколы могут быть легко изменены для зонда важнейшие процессы в других бактерий.

Целевой объект специфического маркировки wildtype A. tumefaciens клетки Для того чтобы проиллюстрировать что морфологии клеток не влияет мыть шаги или лечение с 1% ДМСО, (который используется для разбавления флуоресцентных красителей), клетки ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Понимание функции основных процессов в бактерий является сложной задачей. Микроскопии флуоресцирования целевой объект специфического красителями может обеспечить понимание ключевых микробных клеток роста и клеточный цикл прогрессии. Здесь Agrobacterium tumefaciens используется как модель бактерии для выделения методы для живых клеток изображений для характеризации основных процессов.

Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Live-Cell Imaging жизненного цикла бактериального хищника Bdellovibrio бактериоворуса с использованием Time-Lapse флуоресценции микроскопии

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Измерение динамики протрузии клеточного края во время распространения с помощью микроскопии живых клеток

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...