Name: combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

Wij zijn dankbaar aan Dr Kozo Tanaka van de Universiteit van Tohoku, Japan voor het delen van HeLa cellen stabiel uiting van mCherry-Histone H2B en GFP-α-tubuline. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NCI aan DV (R00CA178188) en start-up middelen van de Northwestern University.

1. dubbele Thymidine blok en Release: reagens preparaten
<ol><li>Make 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, penicilline en streptomycine.</li>
	<li>Maak 100 mM voorraad van thymidine in steriel water en winkel in aliquots bij-80 ° C.</li>
</ol>2. protocol voor vaste cel beeldvorming van mitotische progressie (figuur 1A)
<ol><li>Op dag 1, zaad ~ 2 x 105 HeLa cellen in de putjes van de plaat van een 6-well met een ...

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function.">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).</li><li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases.">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li><li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells.">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

Het belangrijkste voordeel van dubbele thymidine synchronisatie is bevat het een uitgebreide steekproef-grootte van mitotische cellen in een korte tijd venster met veel van deze cellen invoeren van mitose in unison, waardoor ook analyses van chromosoom uitlijning, bipolaire spindel vorming en scheiding van het chromosoom met een veel hoger rendement.
Vele regelgevende eiwitcomplexen en signaalroutes zijn gewijd aan het waarborgen van de normale progressie door middel van mitose en deregulering...

In de celcyclus ondergaan cellen een aantal sterk gereguleerde en stoffelijk gecontroleerde gebeurtenissen voor de nauwkeurige duplicatie van hun genoom en proliferatie. Bij zoogdieren bestaat de celcyclus uit interfase en M-fase. In de interfase, die bestaat uit drie fasen - G1, S en G2, de cel duplicaten zijn genoom en ondergaat groei die nodig is voor de normale celcyclus progressie1,2. In de M-fase, die uit de mitose (profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase) en cytokinese bestaat, produceert een ouderlijke cel twee genetisch identieke dochtercellen. In de mitose, zuster chromatiden van gedupliceerde genoom zijn verkorte (profase) en op hun kinetochoren worden vastgelegd door de microtubuli van de geassembleerde mitotische spindel (prometaphase), drijft dat de uitlijning op de metafase-plaat (metafase), gevolgd door hun gelijk segregatie als zuster chromatiden zijn gesplitst naar en getransporteerd naar tegenovergestelde spindel palen (anafase). De twee dochtercellen worden fysiek gescheiden door de activiteit van een actine gebaseerde contractiele ring (telofase en cytokinese). De kinetochoor is een gespecialiseerde eiwithoudende structuur die in de centromeric regio van chromatiden assembleert en dienen als bijlage sites voor spindel microtubuli. Haar belangrijkste functie is te rijden van chromosoom vastleggen, uitlijning, en hulp bij het corrigeren van onjuiste spindel microtubulus bijlage, terwijl de spindel vergadering controlepost te handhaven van de trouw van het chromosoom segregatie3,4te bemiddelen.
De techniek van cel synchronisatie fungeert als een ideaal hulpmiddel voor het begrijpen van de molecuul- en structuurformule gebeurtenissen die betrokken zijn bij de celcyclus. Deze aanpak is gebruikt om te verrijken cel populaties in specifieke fasen voor verschillende soorten analyses, met inbegrip van profilering van genexpressie, analyses van cellulaire biochemische processen, en detectie van subcellular localisatie van eiwitten. Gesynchroniseerde zoogdiercellen kunnen worden gebruikt, niet alleen voor de studie van individuele genproducten, maar ook voor een aanpak met betrekking tot de analyse van hele genomen, met inbegrip van microarray analyse van gen expressie5, miRNA expressie patronen6, translationeel verordening7, en Proteoom analyse van eiwit wijzigingen8. Synchronisatie kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van genexpressie of eiwit knock-down of knock-out, of van chemische stoffen op de celcyclus.
Cellen kunnen worden gesynchroniseerd in de verschillende stadia van de celcyclus. Zowel de fysische en chemische methoden worden veel gebruikt voor de synchronisatie van de cel. De belangrijkste criteria voor synchronisatie van de cel zijn dat synchronisatie noncytotoxic en omkeerbaar moet. Vanwege de mogelijke negatieve cellulaire gevolgen cellen door farmacologische agenten te synchroniseren, kunnen afhankelijk van de chemische methoden nuttig zijn voor de studie van de celcyclus belangrijke gebeurtenissen. Bijvoorbeeld hydroxyurea, amphidicolin, mimosine en Lovastatine, kunnen worden gebruikt voor de synchronisatie van de cel in G1/S fase maar vanwege hun effect op de biochemische pathways, die ze remmen, ze activeren celcyclus checkpoint mechanismen en doden een belangrijke Fractie van de cellen9,10. Aan de andere kant, kan feedback remming van de DNA-replicatie door thymidine toe te voegen aan de groei-media, bekend als "thymidine blok", de celcyclus op bepaalde punten11,12,13arresteren. Cellen kunnen ook worden gesynchroniseerd op G2/M fase door behandeling met nocodazole en RO-33069,14. Nocodazole, waardoor microtubulus vergadering, heeft een relatief hoge cytotoxiciteit. Bovendien kunnen nocodazole-gearresteerd cellen terug naar interfase precociously door mitotische ontsporing. Dubbele thymidine blok arrestatie cellen in G1/S fase en na vrijlating uit het blok cellen worden gevonden om door te gaan synchroon door G2 en in de mitose. De normale voortgang van de celcyclus voor cellen verlost van thymidine blok kan worden waargenomen onder hoge resolutie confocale microscopie door cel fixatie of levende imaging. Het effect van verstoring van de mitotische eiwitten kan worden bestudeerd specifiek wanneer cellen invoert en ga door mitose na vrijlating uit dubbele thymidine blok. Cdt1, een multifunctionele eiwit, is betrokken bij het DNA replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase en is ook vereist voor kinetochoor microtubulus bijlagen tijdens de mitose15. Studeren de functie van Cdt1 tijdens de mitose, moet men een methode die het effect van de uitputting op replicatie licenties tijdens de G1-fase, terwijl tegelijkertijd het verrichten van de uitputting specifiek tijdens de G2/M fase alleen vermijdt te hanteren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen die zijn gebaseerd op de dubbele thymidine blok te bestuderen van de mitotische rol van eiwitten die meerdere functies tijdens verschillende stadia van de celcyclus door zowel vaste als live-cel imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s (1X) L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>319-85-070</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063 (Pen Strep)</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmafect2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>103056</td>
			<td>Dissolved in sterile distiled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdt1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hec1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-&#945;-tubulin and mCherry H2B</td>
			<td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc32293</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit ant-Zwint1</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-781A</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-&#947;H2AX (Ser139)</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>05-626, clone JBW301</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamine Red-X</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 6 well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35MM Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc for confocal</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 wave length laser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation System for Microscopes</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

Studie van de verschillende regelgevende gebeurtenissen van de celcyclus in een fase-afhankelijke manier biedt een duidelijk inzicht over celgroei en deling. De synchronisatie van cel populaties in specifieke stadia van de celcyclus is gevonden zeer nuttig in dergelijke experimentele inspanningen. Synchronisatie van cellen door behandeling met chemische stoffen die relatief minder giftig zijn kan nuttig zijn over het gebruik van farmacologische remmende geneesmiddelen voor de studie van de daaruit voortvloeiende celcyclus gebeurtenissen en specifieke verrijking van geselecteerde mitotische fasen te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol voor synchroniseren menselijke cellen in verschillende stadia van de cel cyclus, met inbegrip van zowel in S-fase en M fase met een dubbele thymidine blok en vrijgeven van de procedure voor het bestuderen van de functionaliteit van de mitotische eiwitten in chromosoom uitlijning en segregatie. Dit protocol is uiterst nuttig voor het bestuderen van de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die gevestigde interfase functies bezitten. In ons geval, kan de mitotische rol van Cdt1, een proteïne essentieel voor replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase, effectief alleen wanneer G2/M-specifieke Cdt1 kan worden uitgeput worden bestudeerd. We beschrijven het gedetailleerd protocol voor uitputting van G2/M-specifieke Cdt1 met dubbele thymidine synchronisatie. We hebben ook uitleggen van het protocol van cel fixatie, en leven cel geschikt zijn met behulp van hoge resolutie confocale microscopie na thymidine release. De methode is ook handig voor het analyseren van de functie van de mitotische eiwitten onder zowel fysiologische en verontrust voorwaarden zoals Hec1, een onderdeel van het Ndc80 complex, omdat het een tot het verkrijgen van grote steekproeven van mitotische cellen voor vaste en levende cel in staat stelt analyse zoals we hier laten zien.

Studie van de mitotische progressie en microtubulus stabiliteit in cellen vast na vrijlating uit dubbele thymidine blok Cdt1 is betrokken bij de licentiëring van DNA replicatie oorsprong in de G1-fase. Het tijdens de S-fase is afgebroken, maar opnieuw accumuleert in G2/M fase. Om te bestuderen zijn rol in de mitose, moet de endogene Cdt1 worden uitgeput specifiek gericht is op de met behulp van de meest geschikte cel synchronisatie techniek, de dubbele thymidine blok<...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

The overall goal of this procedure is to use double thymidine synchronization and high-resolution confocal microscopy to study the mitotic roles of multifunctional proteins that may possess critical interphase functions. This method can help answer key questions in the cell biology field, about how to delineate the normal functions of proteins involved in cell cycle and mitosis. The main advantages of this technique are that, the cells can maintain their normal physiological behavior and that this method is also very easy to perform.Demonstrating this procedure will be Dr.Mohammed Amin, a post-doc from my laboratory, who is an expert in the use of this method. For fixed cell imaging of mitotic cell progression, begin by seeding approximately two times 10 to the fifth HeLa cells into each well of a six-well plate, containing a 70%ethanol and UV sterilized cover slip and two milliliters of DMEM medium. After 24 hours in a cell culture incubator, block the cells with two milliliters of freshly diluted thymidine and fresh medium per well, and return the plate to the incubator for another 18 hours.The next day, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with fresh 37 degree Celsius medium. Return the cells to the incubator for nine hours to release the cells from the block, followed by the addition of another two milliliters of thymidine-supplemented medium per well. After the second blocking incubation, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with two milliliters of fresh 37 degree Celsius medium, and add 100 nanomolar of freshly prepared siRNA to the appropriate wells.After nine to 10 hours, aspirate the supernatant and fix the cells onto the cover slips with four percent paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature. After washing with PBS, permeabilize the fixed cells with 0.5%detergent for 10 minutes at room temperature, followed by two five-minute washes in PBS. Block the cells with one percent BSA in PBS for one hour at room temperature.Then label the cells with 50 microliters of the primary antibodies of interest for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, wash the cells three times in PBS, and label them with 50 microliters of the appropriate secondary antibodies of interest. After one hour at room temperature, wash the cells two times in PBS for five minutes each wash, and label the cells with DAPI for five minutes at room temperature.Follow the DAPI staining with two five-minute washes in PBS and use the appropriate mounting medium to mount the cover slips on individual clear microscope slides. Then, using 60 or 100 X 1.4 numerical aperture plan apochromatic DIC oil immersion objectives mounted on an inverted high resolution confocal microscope equipped with an appropriate camera, acquire images of the immunostained proteins in Z stacks of 0.2 micrometer thickness. For live cell imaging of mitotic cell progression, seed approximately 0.5 to one times 10 to the fifth HeLa cells stably expressing mCherry H2B and GFP alpha-tubulin into 35-milliliter glass-bottom dishes containing 1.5 milliliters of DMEM medium.Grow the cells in a cell culture incubator for 24 hours. Then, thymidine block the cells two times as just demonstrated, this time washing the cells two times with two milliliters of PBS and one time with one milliliter of pre-warmed DMEM medium at the end of each thymidine block and treating the cells with siRNA after the first block during the first thymidine washout. Grow the cells in fresh pre-warmed Leibovitz's medium, supplemented with 10%FBS and 20 millimolar HEPES for eight hours to release the cells from the second block.Then place the first plate in the temperature-controlled chamber of a high-resolution confocal microscope, and use the 60 X objective and bright field imaging to bring the cells into focus. When the cells are visible, manually adjust the plate position to the region of choice and use the image acquisition software to set the laser power and exposure, image acquisition parameters, and experiment duration period. Select the appropriate GFP and mCherry filters and acquire pulsed transmitted light and fluorescence images every 10 minutes for up to 16 hours, to obtain time-lapse images of the mitosis process.Nine hours after release from the double thymidine block, acquire the images at 12 one-micrometer separated z-planes. Then analyze the images by tracking individual mitotic cells and use the appropriate source software to assemble a corresponding movie. Although most of the control and Cdt1 siRNA cells are at the metaphase stage at nine hours post-release from double thymidine block, fixation at 10 hours reveals that most of the Cdt1 siRNA-treated cells are still arrested in late prometaphase, while the control cells enter anaphase and segregate their chromosomes as expected.Cold treatment nine hours after release from double thymidine block facilitates the retention of stable kinetochore microtubules which are relatively less robust in Cdt1-depleted cells compared to those within control-depleted cells. DNA replication origin licensing is not perturbed in Cdt1-or control-depleted cells during the G2-M phase, as these cells were not found to induce the accumulation of phosphoralated gamma H2AX, a marker for DNA damage, during the subsequent G2 phase. Cdt1 siRNA transfection of asynchronous cultures, however, induces the accumulation of phospho gamma H2AX positive foci possibly due to the DNA damage induced by improper DNA replication licensing.After nuclear envelope breakdown, normal cells enter mitosis and undergo anaphase onset to exit from mitosis within about 30 to 60 minutes. RNAi-mediated knockdown of Hec1, a key kinetochore protein required for robust kinetochore microtubule attachment formation, however, delays the normal mitotic progression to anaphase onset or exit from mitosis even after several hours of mitosis delay. Once mastered, this technique can be completed in three to four days if it is performed properly.While attempting the procedure, it's important to remember to dissolve the thymidine completely after you thaw it out from the freezer. Following this procedure, other methods like western blotting can be performed to answer additional questions like, what are the expression patterns of proteins of interest during mitosis compared to interphase? After its development, this technique paved the way for researchers in the field of cell biology to explore cancer biogenesis in human cell culture models, and to use high-resolution confocal microscopy to identify the cell cycle related functions of proteins of interest.Don't forget that working with reagents like paraformaldehyde and DAPI can be extremely hazardous and that precautions such as wearing gloves and a lab coat, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronisatie van<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Voor Onderzoek van de bacteriële cel Cyclus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...