Name: combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

אנחנו אסירי תודה ד ר טנקה Kozo של אוניברסיטת Tohoku, יפן לשיתוף הלה תאים stably לבטא mCherry-היסטון ויזת עבודה H2B ו- GFP-α-טובולין. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NCI DV (R00CA178188) ועל ידי ראשונית מאוניברסיטת נורת'ווסטרן.

1. כפול תימידין בלוק ושחרור: ריאגנט ההכנות
<ol><li>להפוך 500 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS פניצילין, סטרפטומיצין.</li>
	<li>להכין מלאי 100 מ מ של תימידין במים סטריליים, בחנות aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. פרוטוקול עבור תא קבוע הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 1 א'</s...

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function.">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).</li><li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases.">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li><li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells.">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

היתרון הקריטי ביותר של תימידין זוגי הסינכרון הוא שהיא מספקת גודל המדגם מוגברת של תאים mitotic בחלון זמן קצר עם רבים של תאים אלו נכנסים מיטוזה שבסיר, ובכך מאפשר גם ניתוחים של כרומוזום יישור, הפרעה דו קוטבית ציר היווצרות, סגרגציה כרומוזום עם הרבה יעילות גבוהה יותר.
רבים מתחמי חלב?...

במחזור התא, התאים עוברים סדרה של אירועים מאוד מוסדר ומבוקר חנותם עבור שכפול מדויק הגנום שלהם והתפשטות. ביונקים, מחזור התא מורכב לאטמוספרה, M-פאזי. ב. לאטמוספרה, אשר כוללת שלושה שלבים - G1, S, ו G2, התא משכפלת את הגנום שלו עובר הצמיחה כי הוא הכרחי עבור מחזור תא נורמלי התקדמות1,2. בשלב ז-, אשר מורכב של מיטוזה (prophase prometaphase, מפה של, "אנאפאזה", אשהה) וציטוקינזה, תא הורים מייצרת שני תאים זהים גנטית בת. ב מיטוזה, אחותי chromatids של הגנום המשוכפלת מרוכז (prophase) הינם בשבי ב שלהם kinetochores על ידי microtubules בכישור mitotic שהורכב (prometaphase), שמניע את היישור שלהן למשטח מפה של (כל) ואחריו שלהם שווה סגרגציה כאשר אחותי chromatids פיצול לכיוון והועברו לאתר פלך מול הפולנים ("אנאפאזה"). שני התאים הבת מופרדים פיזית באמצעות הפעילות של מבוססי אקטין כויץ טבעת (אשהה וציטוקינזה). קינטוכור מבנה proteinaceous מיוחדים אשר מרכיבה על האזור centromeric של chromatids, לשמש אתרי מצורף עבור ציר microtubules. הפונקציה העיקרית היא לנהוג כרומוזום לכידת, יישור, וסיוע בתיקון מצורף microtubule פלך פסולים, בעוד תיווכה במחסום מכלול ציר כדי לשמור על אמינות של כרומוזום סגרגציה3,4.
הטכניקה של סינכרון תא משמש כלי אידיאלי להבנת האירועים מבניים המולקולריים המעורבים בהתקדמות מחזור התא. גישה זו שימש כדי להעשיר את אוכלוסיות תאים-שלבים ספציפיים עבור סוגים שונים של ניתוחים, כולל בניית פרופיל של ביטוי גנים, ניתוח של תהליכים ביוכימיים הסלולר, וזיהוי של לוקליזציה subcellular של חלבונים. תאים בתרבית של מסונכרן יכול לשמש לא רק לצורך המחקר של מוצרים גנים בודדים, אלא גם עבור גישות הכוללים ניתוח של הגנום כולו כולל ניתוח microarray של ביטוי גנים5, דפוסי ביטוי miRNA6, translational בתקנה7, וניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון שינויים8. סינכרון יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של ביטוי גנים או חלבון דפיקה למטה או הנוק-אאוט, או של כימיקלים על התקדמות מחזור התא.
ניתן לסנכרן תאים בשלבים שונים של מחזור התא. השיטות הפיסיקליות והכימיות נמצאים בשימוש נרחב עבור תא סינכרון. הקריטריונים החשובים ביותר עבור סינכרון תא הם כי סינכרון צריך להיות noncytotoxic ולא הפיך. בגלל תופעות לוואי הסלולר ההשלכה הפוטנציאלית של סינכרון תאים על ידי סוכנים תרופתי, שיטות תלויי-כימי יכול להיות יתרון ללימוד אירועי מפתח מחזור התא. לדוגמה, הידרוקסיוראה, amphidicolin, mimosine ו- lovastatin, יכול לשמש עבור סינכרון תא בשלב G1/S אבל, בגלל השפעתם על המסלולים הביוכימי שמונעים, הם להפעיל מנגנוני הביקורת מחזור התא להרוג חשובה שבר של תאי ה-9,10. מצד שני, משוב עיכוב של שכפול ה-DNA על-ידי הוספת תימידין התקשורת צמיחה, המכונה "תימידין בלוק", יכולים לעצור את מחזור התא בגיל12,11,13מסוימים נקודות. תאים גם ניתן לסנכרן בשלב G2/M על-ידי טיפול עם nocodazole,9,RO-330614. Nocodazole, אשר מונע microtubule הרכבה, כולל של cytotoxicity גבוה יחסית. יתר על כן, נעצר nocodazole תאים באפשרותך לחזור לאטמוספרה precociously על ידי גלישה mitotic. כפול תימידין בלוק מעצר תאים בשלב G1/S, לאחר שחרורו מן הרחוב, נמצאו תאים כדי להמשיך באופן סינכרוני דרך G2 ולתוך מיטוזה. התקדמות נורמלי של מחזור התא עבור תאים שוחררו תימידין בלוק יכול להיות שנצפו תחת קונפוקלית ברזולוציה גבוהה על ידי קיבוע תאים או הדמיה בשידור חי. ניתן יהיה ללמוד את השפעת ההפרעות של חלבונים mitotic במיוחד כאשר תאים הזן והמשך דרך מיטוזה לאחר שחרורו של תימידין זוגי בלוק. Cdt1, חלבון רב תכליתיים, מעורב מקור שכפול ה-DNA רישוי בשלב G1 ויש גם צורך קינטוכור microtubule מצורפים במהלך מיטוזה15. ללמוד את הפונקציה של Cdt1 במהלך מיטוזה, אחד צריך לאמץ שיטה זה מונע את השפעת המחסור שלה על שכפול רישוי במהלך שלב G1, בזמן בו זמנית שמצריכות שלה דלדול במיוחד במהלך שלב G2/M בלבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורט המבוסס על הבלוק תימידין זוגי ללמוד את התפקיד mitotic של חלבונים ביצוע פונקציות מרובות בשלבים שונים של מחזור התא על ידי הדמיה קבוע והן לחיות תאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s (1X) L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>319-85-070</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063 (Pen Strep)</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmafect2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>103056</td>
			<td>Dissolved in sterile distiled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdt1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hec1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-&#945;-tubulin and mCherry H2B</td>
			<td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc32293</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit ant-Zwint1</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-781A</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-&#947;H2AX (Ser139)</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>05-626, clone JBW301</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamine Red-X</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 6 well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35MM Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc for confocal</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 wave length laser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation System for Microscopes</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

חקר האירועים הרגולציה השונים של מחזור התא באופן תלוי-שלב מספק הבנה ברורה לגבי צמיחת תאים וחלוקה. הסינכרון של אוכלוסיות תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא כבר מצאו להיות מאוד שימושי לנסיונות ניסיוני כאלה. סינכרון של תאים על ידי טיפול בכימיקלים רעילים יחסית פחות יכול להיות יתרון על השימוש בתרופות מעכבות תרופתי לחקר אירועי מחזור התא הסוגר וכדי להשיג העשרה ספציפי של שלבים mitotic שנבחרו. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור סינכרון תאים אנושיים בשלבים שונים של התא מחזור, כולל שני ב S שלב ושלב מ' עם בלוק תימידין זוגי ולשחרר את נוהל לומד את הפונקציונליות של חלבונים mitotic במערך כרומוזום סגרגציה. פרוטוקול זה היה שימושי ביותר ללמוד את התפקידים mitotic של חלבונים רב תכליתי אשר בעלי פונקציות הוקמה לאטמוספרה. במקרה שלנו, התפקיד mitotic של Cdt1, חלבון קריטי עבור שכפול מקור רישוי בשלב G1, ניתן יהיה ללמוד בצורה יעילה רק כאשר Cdt1 G2/M-ספציפי יכול להיות מרוקנים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור דלדול של Cdt1 G2/M-ספציפי באמצעות סינכרון תימידין כפול. אנחנו גם להסביר את הפרוטוקול של קיבוע תא, ולחיות תא הדמיה באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שחרורו תימידין. השיטה היא שימושית גם עבור ניתוח תפקידו של חלבונים mitotic בתנאים פיסיולוגיים והן מודאג כגון עבור Hec1, מרכיב Ndc80 מורכבים, כמו זה, המאפשר לקבל גודל מדגם גדול של תאים mitotic תא קבוע ולחיות ניתוח כפי שנראה כאן.

מחקר של התקדמות mitotic ויציבות microtubule בתאים קבוע לאחר שחרור כפול תימידין בלוק Cdt1 מעורב רישוי ממוצא שכפול ה-DNA בשלב G1. זה יורד במהלך שלב S אבל מצטברת בשלב G2/M. כדי ללמוד תפקידה מיטוזה, Cdt1 אנדוגני צריכה להיות דלה במיוחד בשלב G/M בטכניקה המתאימה ביותר תא סינכרון, בלוק תימ?...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

The overall goal of this procedure is to use double thymidine synchronization and high-resolution confocal microscopy to study the mitotic roles of multifunctional proteins that may possess critical interphase functions. This method can help answer key questions in the cell biology field, about how to delineate the normal functions of proteins involved in cell cycle and mitosis. The main advantages of this technique are that, the cells can maintain their normal physiological behavior and that this method is also very easy to perform.Demonstrating this procedure will be Dr.Mohammed Amin, a post-doc from my laboratory, who is an expert in the use of this method. For fixed cell imaging of mitotic cell progression, begin by seeding approximately two times 10 to the fifth HeLa cells into each well of a six-well plate, containing a 70%ethanol and UV sterilized cover slip and two milliliters of DMEM medium. After 24 hours in a cell culture incubator, block the cells with two milliliters of freshly diluted thymidine and fresh medium per well, and return the plate to the incubator for another 18 hours.The next day, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with fresh 37 degree Celsius medium. Return the cells to the incubator for nine hours to release the cells from the block, followed by the addition of another two milliliters of thymidine-supplemented medium per well. After the second blocking incubation, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with two milliliters of fresh 37 degree Celsius medium, and add 100 nanomolar of freshly prepared siRNA to the appropriate wells.After nine to 10 hours, aspirate the supernatant and fix the cells onto the cover slips with four percent paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature. After washing with PBS, permeabilize the fixed cells with 0.5%detergent for 10 minutes at room temperature, followed by two five-minute washes in PBS. Block the cells with one percent BSA in PBS for one hour at room temperature.Then label the cells with 50 microliters of the primary antibodies of interest for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, wash the cells three times in PBS, and label them with 50 microliters of the appropriate secondary antibodies of interest. After one hour at room temperature, wash the cells two times in PBS for five minutes each wash, and label the cells with DAPI for five minutes at room temperature.Follow the DAPI staining with two five-minute washes in PBS and use the appropriate mounting medium to mount the cover slips on individual clear microscope slides. Then, using 60 or 100 X 1.4 numerical aperture plan apochromatic DIC oil immersion objectives mounted on an inverted high resolution confocal microscope equipped with an appropriate camera, acquire images of the immunostained proteins in Z stacks of 0.2 micrometer thickness. For live cell imaging of mitotic cell progression, seed approximately 0.5 to one times 10 to the fifth HeLa cells stably expressing mCherry H2B and GFP alpha-tubulin into 35-milliliter glass-bottom dishes containing 1.5 milliliters of DMEM medium.Grow the cells in a cell culture incubator for 24 hours. Then, thymidine block the cells two times as just demonstrated, this time washing the cells two times with two milliliters of PBS and one time with one milliliter of pre-warmed DMEM medium at the end of each thymidine block and treating the cells with siRNA after the first block during the first thymidine washout. Grow the cells in fresh pre-warmed Leibovitz's medium, supplemented with 10%FBS and 20 millimolar HEPES for eight hours to release the cells from the second block.Then place the first plate in the temperature-controlled chamber of a high-resolution confocal microscope, and use the 60 X objective and bright field imaging to bring the cells into focus. When the cells are visible, manually adjust the plate position to the region of choice and use the image acquisition software to set the laser power and exposure, image acquisition parameters, and experiment duration period. Select the appropriate GFP and mCherry filters and acquire pulsed transmitted light and fluorescence images every 10 minutes for up to 16 hours, to obtain time-lapse images of the mitosis process.Nine hours after release from the double thymidine block, acquire the images at 12 one-micrometer separated z-planes. Then analyze the images by tracking individual mitotic cells and use the appropriate source software to assemble a corresponding movie. Although most of the control and Cdt1 siRNA cells are at the metaphase stage at nine hours post-release from double thymidine block, fixation at 10 hours reveals that most of the Cdt1 siRNA-treated cells are still arrested in late prometaphase, while the control cells enter anaphase and segregate their chromosomes as expected.Cold treatment nine hours after release from double thymidine block facilitates the retention of stable kinetochore microtubules which are relatively less robust in Cdt1-depleted cells compared to those within control-depleted cells. DNA replication origin licensing is not perturbed in Cdt1-or control-depleted cells during the G2-M phase, as these cells were not found to induce the accumulation of phosphoralated gamma H2AX, a marker for DNA damage, during the subsequent G2 phase. Cdt1 siRNA transfection of asynchronous cultures, however, induces the accumulation of phospho gamma H2AX positive foci possibly due to the DNA damage induced by improper DNA replication licensing.After nuclear envelope breakdown, normal cells enter mitosis and undergo anaphase onset to exit from mitosis within about 30 to 60 minutes. RNAi-mediated knockdown of Hec1, a key kinetochore protein required for robust kinetochore microtubule attachment formation, however, delays the normal mitotic progression to anaphase onset or exit from mitosis even after several hours of mitosis delay. Once mastered, this technique can be completed in three to four days if it is performed properly.While attempting the procedure, it's important to remember to dissolve the thymidine completely after you thaw it out from the freezer. Following this procedure, other methods like western blotting can be performed to answer additional questions like, what are the expression patterns of proteins of interest during mitosis compared to interphase? After its development, this technique paved the way for researchers in the field of cell biology to explore cancer biogenesis in human cell culture models, and to use high-resolution confocal microscopy to identify the cell cycle related functions of proteins of interest.Don't forget that working with reagents like paraformaldehyde and DAPI can be extremely hazardous and that precautions such as wearing gloves and a lab coat, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

סנכרון של<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; לחקירה של מחזור תא החיידק

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...