Name: combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

Stabil mCherry-Histon H2B ve GFP-α-tübülin ifade HeLa hücreleri paylaşımı için Tohoku Üniversitesi, Japonya'nın Dr Kozo Tanaka için minnettarız. Bu eser DV (R00CA178188) için bir ncı hibe ve Northwestern Üniversitesi'nden başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir.

1. çift timidin blok ve yayın: reaktif hazırlıkları
<ol><li>500 mL Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) orta %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş değişiklik yapmak.</li>
	<li>Steril su ve aliquots-80 ° C'de deposunda timidin stokunun 100 mM olun</li>
</ol>2. sabit hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 1A) için iletişim kuralı
<ol><li>Günde 1, tohum ~ 2 x 105 HeLa hücreleri ile bir kapak (% 70 etanol ve UV radyasyon verm...

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function.">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).</li><li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases.">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li><li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells.">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.
Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis i?...

Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları - G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores monte Mitotik spindle (prometafaz), mikrotübüller tarafından yakalanır kız kardeşi bu sürücüler onların hizalama metafaz ardından plaka (metafaz) onların Ne zaman chromatids doğru bölmek ve ters dönüş için yer değiştiren kız kardeşi (anafaz) Polonyalılar segregasyon eşit. İki kızı hücreleri fiziksel olarak bir aktin esaslı contractile yüzüğü (telofaz ve sitokinez) faaliyet tarafından ayrılır. Kinetochore ve chromatids centromeric bölge çeviren özel bir proteinaceous yapı iğ mikrotübüller için ek siteler olarak hizmet. Temel işlevi kromozom yakalama, hizalama, sürücü ve uygunsuz iğ Mikrotubul eki, Milli Meclis denetim noktası kromozom segregasyon3,4kalitesini korumak için arabuluculuk yaparken düzeltme yardım etmektir.
Hücre eşitleme tekniği moleküler ve yapısal olaylar hücre döngüsü ilerlemesinde dahil anlamak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım belirli aşamaları için çeşitli analizler, gen ifadesi, profil oluşturma dahil olmak üzere hücresel biyokimyasal süreçlerin analizleri ve proteinlerin hücre altı yerelleştirme tespiti, hücre popülasyonlarının zenginleştirmek için kullanılmıştır. Eşitlenmiş memeli hücreleri-ebilmek var olmak kullanılmış sadece bireysel gen ürünlerinin incelenmesi için aynı zamanda Analizi Mikroarray analiz gen ifade5, miRNA ifade desenleri6dahil olmak üzere bütün genleri içeren yaklaşımlar için translasyonel yönetmelik7ve protein değişiklikler8proteomik analizi. Eşitleme gen ekspresyonu veya protein knock-down veya knock-out veya kimyasal maddelerin etkileri, hücre döngüsü gelişimi çalışma için kullanılabilir.
Hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında eşitlenebilir. Hem fiziksel hem de kimyasal yöntemler hücre senkronizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Hücre eşitlemesi için en önemli kriterleri eşitleme noncytotoxic ve geri dönüşümlü olması gerekir vardır. Hücreleri farmakolojik ajanlar tarafından eşitleme potansiyel olumsuz hücresel sonuçları nedeniyle, kimyasal bağımlı yöntemleri anahtar hücre döngüsü olaylar eğitim için avantajlı olabilir. Örneğin, hidroksiüreye, amphidicolin, mimosine ve lovastatin, G1/S faz hücre eşitleme için kullanılabilir ancak, onlar inhibe biyokimyasal yolları üzerindeki etkileri nedeniyle onlar hücre döngüsü kontrol noktası mekanizmaları etkinleştirmek ve önemli bir öldürmek kesir hücreleri9,10. Öte yandan, DNA ikileşmesi "timidin taşı" olarak bilinen büyüme basına timidin ekleyerek geribildirim inhibisyonu hücre döngüsünün belirli Puan11,12,13tutuklayabilirsin. Hücreleri de G2/M aşamasında nocodazole ve RO-33069,14ile tedavisi ile senkronize edilebilir. Nocodazole Mikrotubul derleme önleyen bir nispeten yüksek sitotoksisite vardır. Ayrıca, hücreleri nocodazole tutuklandı tanımışlar tarafından Mitotik kayma Interphase geri dönebilirim. Çift timidin blok tutuklama hücreleri G1/S faz ve blok sürümden sonra zaman uyumlu olarak G2 ve mitoz içine devam etmek için hücreleri bulunur. Timidin bloğundan çıkış hücrelerin hücre döngüsünün normal ilerleme yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu altında hücre fiksasyon veya canlı görüntüleme tarafından görülebilir. Özellikle hücre girin ve mitoz Kişilik timidin blok sürümden sonra devam pertürbasyon Mitotik proteinlerin etkisi okudu. Cdt1, çok fonksiyonlu bir protein DNA çoğaltma kaynağı G1 aşamasında lisansı içinde yer alan ve aynı zamanda mitoz15sırasında kinetochore Mikrotubul ekleri için gereklidir. Cdt1 fonksiyonu mitoz sırasında çalışmaya bir lisans çoğaltmayı G1 aşamasında, aynı zamanda onun tükenmesi özellikle aşamasında G2/M sadece etkileyen üzerinde onun tükenmesi etkisini önler bir yöntem evlat edinmek gerekiyor. Burada, sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından birden fazla işlevi hücre döngüsünün farklı aşamalarında gerçekleştirme proteinlerin Mitotik rol çalışmaya Çift Kişilik timidin blok dayalı ayrıntılı iletişim kuralları mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s (1X) L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>319-85-070</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063 (Pen Strep)</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmafect2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>103056</td>
			<td>Dissolved in sterile distiled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdt1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hec1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-&#945;-tubulin and mCherry H2B</td>
			<td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc32293</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit ant-Zwint1</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-781A</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-&#947;H2AX (Ser139)</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>05-626, clone JBW301</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamine Red-X</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 6 well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35MM Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc for confocal</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 wave length laser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation System for Microscopes</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.

Mitotik ilerleme ve Mikrotubul istikrar hücrelerde çalışma çift timidin blok sürümden sonra sabit Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri G1 aşamasında lisansı içinde yer almaktadır. S aşamasında bozulmuş ama G2/M aşamasında yeniden birikir. Mitoz rolü çalışmaya, endojen Cdt1 en uygun hücre eşitleme tekniği Çift Kişilik timidin blok15kullanarak özellikle G/M aşamasında tükenmiş gerekiyor. Hücreleri faz ve hangi zaman çoğ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis at JoVE

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

The overall goal of this procedure is to use double thymidine synchronization and high-resolution confocal microscopy to study the mitotic roles of multifunctional proteins that may possess critical interphase functions. This method can help answer key questions in the cell biology field, about how to delineate the normal functions of proteins involved in cell cycle and mitosis. The main advantages of this technique are that, the cells can maintain their normal physiological behavior and that this method is also very easy to perform.Demonstrating this procedure will be Dr.Mohammed Amin, a post-doc from my laboratory, who is an expert in the use of this method. For fixed cell imaging of mitotic cell progression, begin by seeding approximately two times 10 to the fifth HeLa cells into each well of a six-well plate, containing a 70%ethanol and UV sterilized cover slip and two milliliters of DMEM medium. After 24 hours in a cell culture incubator, block the cells with two milliliters of freshly diluted thymidine and fresh medium per well, and return the plate to the incubator for another 18 hours.The next day, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with fresh 37 degree Celsius medium. Return the cells to the incubator for nine hours to release the cells from the block, followed by the addition of another two milliliters of thymidine-supplemented medium per well. After the second blocking incubation, wash the cells two times with two milliliters of PBS, and one time with two milliliters of fresh 37 degree Celsius medium, and add 100 nanomolar of freshly prepared siRNA to the appropriate wells.After nine to 10 hours, aspirate the supernatant and fix the cells onto the cover slips with four percent paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature. After washing with PBS, permeabilize the fixed cells with 0.5%detergent for 10 minutes at room temperature, followed by two five-minute washes in PBS. Block the cells with one percent BSA in PBS for one hour at room temperature.Then label the cells with 50 microliters of the primary antibodies of interest for one hour at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, wash the cells three times in PBS, and label them with 50 microliters of the appropriate secondary antibodies of interest. After one hour at room temperature, wash the cells two times in PBS for five minutes each wash, and label the cells with DAPI for five minutes at room temperature.Follow the DAPI staining with two five-minute washes in PBS and use the appropriate mounting medium to mount the cover slips on individual clear microscope slides. Then, using 60 or 100 X 1.4 numerical aperture plan apochromatic DIC oil immersion objectives mounted on an inverted high resolution confocal microscope equipped with an appropriate camera, acquire images of the immunostained proteins in Z stacks of 0.2 micrometer thickness. For live cell imaging of mitotic cell progression, seed approximately 0.5 to one times 10 to the fifth HeLa cells stably expressing mCherry H2B and GFP alpha-tubulin into 35-milliliter glass-bottom dishes containing 1.5 milliliters of DMEM medium.Grow the cells in a cell culture incubator for 24 hours. Then, thymidine block the cells two times as just demonstrated, this time washing the cells two times with two milliliters of PBS and one time with one milliliter of pre-warmed DMEM medium at the end of each thymidine block and treating the cells with siRNA after the first block during the first thymidine washout. Grow the cells in fresh pre-warmed Leibovitz's medium, supplemented with 10%FBS and 20 millimolar HEPES for eight hours to release the cells from the second block.Then place the first plate in the temperature-controlled chamber of a high-resolution confocal microscope, and use the 60 X objective and bright field imaging to bring the cells into focus. When the cells are visible, manually adjust the plate position to the region of choice and use the image acquisition software to set the laser power and exposure, image acquisition parameters, and experiment duration period. Select the appropriate GFP and mCherry filters and acquire pulsed transmitted light and fluorescence images every 10 minutes for up to 16 hours, to obtain time-lapse images of the mitosis process.Nine hours after release from the double thymidine block, acquire the images at 12 one-micrometer separated z-planes. Then analyze the images by tracking individual mitotic cells and use the appropriate source software to assemble a corresponding movie. Although most of the control and Cdt1 siRNA cells are at the metaphase stage at nine hours post-release from double thymidine block, fixation at 10 hours reveals that most of the Cdt1 siRNA-treated cells are still arrested in late prometaphase, while the control cells enter anaphase and segregate their chromosomes as expected.Cold treatment nine hours after release from double thymidine block facilitates the retention of stable kinetochore microtubules which are relatively less robust in Cdt1-depleted cells compared to those within control-depleted cells. DNA replication origin licensing is not perturbed in Cdt1-or control-depleted cells during the G2-M phase, as these cells were not found to induce the accumulation of phosphoralated gamma H2AX, a marker for DNA damage, during the subsequent G2 phase. Cdt1 siRNA transfection of asynchronous cultures, however, induces the accumulation of phospho gamma H2AX positive foci possibly due to the DNA damage induced by improper DNA replication licensing.After nuclear envelope breakdown, normal cells enter mitosis and undergo anaphase onset to exit from mitosis within about 30 to 60 minutes. RNAi-mediated knockdown of Hec1, a key kinetochore protein required for robust kinetochore microtubule attachment formation, however, delays the normal mitotic progression to anaphase onset or exit from mitosis even after several hours of mitosis delay. Once mastered, this technique can be completed in three to four days if it is performed properly.While attempting the procedure, it's important to remember to dissolve the thymidine completely after you thaw it out from the freezer. Following this procedure, other methods like western blotting can be performed to answer additional questions like, what are the expression patterns of proteins of interest during mitosis compared to interphase? After its development, this technique paved the way for researchers in the field of cell biology to explore cancer biogenesis in human cell culture models, and to use high-resolution confocal microscopy to identify the cell cycle related functions of proteins of interest.Don't forget that working with reagents like paraformaldehyde and DAPI can be extremely hazardous and that precautions such as wearing gloves and a lab coat, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Senkronizasyon<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

SNARE Kaçakçılığı kullanarak Geri Dönüşüm Endozomlarını İncelemek ve Analiz Etmek için Mikroskopi Tabanlı Tahlil

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...