Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Onderzoek in de Robinson's lab wordt ondersteund door financiële middelen van Keulen Excellence Cluster op cellulaire Stress reacties in Aging-Associated ziekten, Universiteit van Keulen, Duitsland (CECAD; gefinancierd door de DFG binnen het Excellence-initiatief van de Duitse federale en staat regeringen) en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln fortuin en Maria-Pesch Stichting van de Universiteit van Keulen, Duitsland.

alle stappen met betrekking tot het gebruik van pathogene S. typhimurium moeten worden uitgevoerd in een BSL-2 of een hogere biologische veiligheid niveau faciliteit. De cultuur en de coating van S. Typhimurium, evenals de infectie van het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) moet worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow om verontreiniging te voorkomen. De isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes kan worden uitgevoerd op een bankje van de laborator...

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

Een nieuwe methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen wordt hier beschreven. Na de zachte verstoring van het celmembraan, kunnen bacteriën-bevattende phagosomes worden gemakkelijk gewonnen met behulp van een magnetische rek. We laten zien dat etikettering van de bacteriën de capaciteit van het pathogene agens oplevert behoudt voor het opwekken van ontsteking en niets aan de fagocytische eigenschap van...

Macrofagen circuleren gespecialiseerde fagocytische cellen die detecteren, verzwelgen en degraderen van een buitenlandse deeltje in perifere weefsels, variërend van apoptotic cellen tot invasie van micro-organismen zoals bacteriën aanwezig. Oppervlakte receptor-gemedieerde erkenning van pathogen specifieke markers vaak aanwezig op het oppervlak van micro-organismen (bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen of PAMPs) leidt macrofagen een complexe reorganisatie van cellulaire membraan in om te omringen en phagocytize van de pathogeen-1.
Het overspoeld pathogeen is vervolgens opgenomen door de macrofaag in een intracellulair vesikel bekend als phagosome. Door een reeks van kernfusie en kernsplijting evenementen met andere blaasjes zoals Endosomen en lysosomes verwerft de pathogeen-bevattende phagosome een reeks eiwitten die nodig zijn voor de afschaffing van de phagosomal inhoud. Daarom is de enzymatische samenstelling van de phagosome in de loop van dit proces, bekend als phagosome rijping2zeer variabel.
Kort na de fagocytose, de multimeric complexe vacuolar ATPase (v-ATPase) is opgenomen in het phagosome-membraan door fusie met Endosomen3. Dit complex maakt gebruik van ATP aan pomp protonen uit het cytosol naar het lumen van het phagosome4. Verzuring van de phagosome is essentieel voor de gebeurtenissen van de fusie met andere blaasjes5 en voor de activatie van een groot aantal pH-afhankelijke afbraakroutes enzymen6. Een ander multimeric enzymatische complex dat is snel gemonteerd op het phagosome-membraan is het complex van NADPH-oxidase (NOX). NOX complexe oxideert NADPH om te produceren van reactieve zuurstof soorten (ROS) die worden uitgescheiden in de phagosome lumen en die aanzienlijk bijdragen tot het doden van de overspoeld micro-organismen7.
Tijdens de eerste stappen van rijping presenteren phagosomes markeringen typisch zoals Rab5 en Rab7 van vroege en late Endosomen respectievelijk samen met de subeenheid0 V van de v-ATPase-8. Fusie van phagosomes met lysosomen en laat Endosomen resulteert in de blootstelling van de phagocytized pathogen aan een breed scala aan hydrolytische enzymen zoals β-galactosidase9cathepsin proteasen en lipasen. Verzuring van de lumen is ook vereist voor de activering van deze enzymen. Bijvoorbeeld, is het splijten van cathepsin D voor de productie van de actieve korte vorm pH-afhankelijke10. Deze enzymen degraderen van het pathogene agens en bemiddelen van de productie van pathogen afkomstige korte peptides, die door de macrofaag grote histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen naar T cellen activeren een adaptieve immuunrespons11gepresenteerd.
Vandaar, phagosome rijping is cruciaal voor de aangeboren immuunrespons en verbindt de aangeboren en adaptieve takken van het immuunsysteem. Het is geen verrassing dat de ziekteverwekkers geëvolueerd zijn strategieën om te overwinnen afschaffing door macrofagen door het hierboven beschreven proces van rijping van de phagosome. Bijvoorbeeld de intracellulaire bacteriën Mycobacterium tuberculosis en Legionella pneumophila voorkomen dat phagosome rijping remmende v-ATPase vergadering en daaruit voortvloeiende lumen verzuring met12,13 . Andere bacteriën, zoals Listeria monocytogenes of Shigella flexneri induceren porie vorming in het membraan van de phagosome te ontsnappen naar het cytosol14,15. Aan de andere kant, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is het kundig voor wijzigen van de eigenschappen van de phagosome binnen de vacuole om te zetten in een geschikte locatie voor de replicatie-16. Dit vermogen maakt S. typhimurium een zeer interessant model te bestuderen van de pathogeen-gemedieerde inmenging van phagosome rijping.
S. typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. Typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en deel uitmaakt van phagosomes17. Sommige rapporten hebben eerder beschreven dat S. typhimurium-met phagosomes presenteren makers voor zowel Endosomen als lysosomen18, en andere studies hebben gevonden phagosome-lysosoom fusion voorkomen op S. Typhimurium infectie19.
In eerste instantie phagosome rijping op S. typhimurium infectie is onderzocht door immunofluorescentie microscopie. De ontwikkeling van technieken voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes ingeschakeld een nauwkeuriger onderzoek van de inhoud van de phagosome in termen van endosome en lysosoom markers. Tot op heden, de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes is de subcellular fractionering op sacharose stap verlopen18,20. Deze methode vereist echter meerdere centrifugeren stappen die kunnen leiden tot mechanische schade aan phagosomes, kunnen invloed hebben op de stabiliteit van de phagosomal componenten (eiwitten en lipiden) en tijdrovend is. Bovendien, het vereist het gebruik van een ultracentrifuge: een stuk van gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk zijn voor elke laboratorium.
Onlangs, een nieuwe aanpak is toegepast op de isolatie van bacteriële-bevattende phagosomes, waarin de bacteriële pathogenen worden aangeduid met biotinyleerd lipopetide (Lipobiotin) en later geëxtraheerd met behulp van streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen21 . Wij stellen een alternatieve complementaire methode door het labelen van bacteriële oppervlakte amine-bevattende macromoleculen met NHS-Biotine gevolgd door daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen zijn hoogverrijkt in endosome en lysosoom markers en kunnen worden gebruikt voor een breed scala van tests, uit eiwit analyse omics analyse. Bovendien, vereist het geen gespecialiseerde apparatuur zoals ultracentrifuges. Bovendien, door het elimineren van de stappen van centrifugeren, zowel de mechanische schade aan phagosomes en de hoeveelheid tijd werkzaam zijn aanzienlijk kleiner zijn. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de isolatie van de phagosomes met andere bacteriën, zoals de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, ook opgenomen in dit manuscript. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is een eenvoudige, kosteneffectieve, en minder tijdrovend dan het klassieke isolement door sacharose verrijkt verloop-ultracentrifugatie, waardoor zeer phagosomes bacteriën bevatten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en in blaasjes bekend als phagosomes om te worden afgebroken. Isolatie van S. typhimurium-met phagosomes hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hoe S. typhimurium infectie verandert het proces van rijping van het phagosome ter voorkoming van bacteriële afbraak. Klassiek, het isolement van de bacteriën-bevattende phagosomes is verricht door sacharose kleurovergang centrifugeren. Dit proces is echter tijdrovend, en vereist gespecialiseerde apparatuur en een zekere mate van beweeglijkheid. Hier beschreven is een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine-daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen kunnen worden opgeschort in een buffer van keuze, waardoor het gebruik van geïsoleerde phagosomes voor een breed scala van tests, zoals eiwitten, metaboliet, en lipide-analyse. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is specifiek, efficiënte, snelle, vereist minimale apparatuur en is veelzijdiger dan de klassieke methode van isolatie door sacharose verloop-ultracentrifugatie.

Isolatie van bacteriën-bevattende phagosomes door dit protocol vereist de biotinylation van de bacteriën als een eerste stap. We daarom beoordeeld de effectiviteit van S. typhimurium biotinylation door analyse van de confocal microscopie van BMDMs geïnfecteerd met biotinyleerd mCherry -S. typhimurium aangeduid met Cy5-daar. Kort, BMDMs waren besmet, zoals beschreven in dit protocol met mCherry -S. typhimurium eerder biotinyleerd maa...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

The overall goal of this procedure is to isolate intact and enriched bacteria containing Phagosomes. This method can help us answer key questions in the field of Immunology such as changes in Phagosome maturation and antigen processing when pathogenic microorganisms invade host cells. The main advantage of the technique is that it produces high quality bacteria containing Phagosomes using simple steps and without a requirement of specialized equipment.Individuals new to the method would find it technically approachable in comparison to the non methodologies. We first had the idea to develop this method when we were studying the mechanisms by which intracellular pathogens hijack the Phagosomes to their advantage. Demonstrating this procedure will be Saray Gutierrez, a post-doc from my laboratory.To start Salmonella Typhimurium culture, use a bacteria loop to inoculate a single bacterial colony into 5 milliliters of brain heart infusion broth. Then incubate the suspension in a 37 degrees Celsius incubator overnight while shaking. Transfer one milliliter of this bacterial suspension into 19 milliliters BHI broth in a conical flask on the following day.Incubate again in 37 degrees Celsius incubator while shaking. When the OD600 reaches one, remove the flask from the incubator and transfer the culture into a 50 milliliter tube. Then centrifuge the tube at 5400 x G at 4 degrees Celsius for 15 minutes.After removing the supernatant, re-suspend the bacterial pellet in 10 milliliters sterile PBS. After repeating the centrifugation once, re-suspend the pellet in 4.9 milliliters of PBS. Next, add 100 microliters of freshly prepared Biotin linking solution to the bacterial suspension.After splitting this suspension into five 1.5 milliliter tubes, incubate in a thermal block at room temperature with constant shaking at 350 rpm for two hours. After centrifuging the tubes at 15, 000 x G at room temperature for ten minutes, discard the supernatant. After two more centrifugation steps and complete removal of the Biotin linking solution, re-suspend this Biotin-coded bacteria in one milliliter sterile PBS in a single 1.5 milliliter tube.Transfer 100 microliters of streptavidin-conjugated magnetic beads solution into a fresh 1.5 milliliter tube and place it in a magnetic rack for five minutes. After removing the solvent from the tube, remove the tube from the magnetic rack. Then re-suspend the beads that remained in the tube with one milliliter of Biotin coded bacterial suspension.Incubate the tube on a thermo block at room temperature for one hour while shaking at 350 rpm. Next, place the tube on the magnetic rack for five minutes. Use a pipette to remove the bacteria that did not adhere to the wall and transfer to a new tube labeled non-coded bacteria.The tube with magnetic beads adhering to the wall contains Biotin Streptavidin coded bacteria. Remove the tube with Biotin Streptavidin coded bacteria from the magnetic rack and re-suspend in one milliliter sterile PBS. After the tube has been on the magnetic rack for five minutes, remove the PBS.Finally, re-suspend the washed Biotin Streptavidin coded bacteria in 500 microliters of sterile PBS and label the tube as coded bacteria. On the day prior to infection, plate fully differentiated BMDMs in a six centimeter dish in RPMIs supplemented with ten percent FBS. On the following day, centrifuge the coded bacterial suspension at 15, 000 x G at four degrees Celsius for five minutes.After removing the supernatant, re-suspend the bacterial pellet in RPMI medium supplemented with ten percent FBS. Remove the medium from the BMDMs and add five milliliters of coded bacterial suspension in RPMI medium in order to infect the cells. To synchronize Phagocytosis, incubate at room temperature for ten minutes.Then to initiate Phagocytosis, incubate at 37 degrees Celsius in a five percent Carbon Dioxide incubator for 30 minutes. After incubation, remove the medium from the dishes and wash the cells three times at RPMI to remove non internalized bacteria. To kill any non-Phagocytized bacteria at ten milliliters of RPMI containing ten percent FBS in 50 micrograms per milliliter Gentamicin.Finally, incubate the infected BMDMs at 37 degrees Celsius in a five percent Carbon Dioxide incubator until the desired time point. First, prepare the volume of required Phagosome Isolation Buffer A by adding DTT and Cytochalasin B just before use and Protease and Phosphatase Inhibitors as recommended by the manufacturer. Remove the medium from the infected cells at the desired time point and wash the cells with sterile PBS pre-warmed to room temperature.Then add 750 microliters of Phagosome Isolation Buffer A to the dish and incubate on ice for 20 minutes. Remember to rock the plate occasionally. Next, add 250 microliters of Phagosome Isolation Buffer B and then rock the plates to ensure that the buffer completely covers the surface.Gently scrape the cells using a rubber policeman to remove the cells from the dish and transfer them to a pre-chilled 1.5 milliliter tube. Then use a one milliliter syringe to pass the cell suspension thru a 26-gauge needle at least 15 times. Next, place the cell suspension on the magnetic rack for five minutes.Particles attached to the magnetic beads are Phagosomes containing coded S.Typhimurium. Transfer then the suspension which contains the rest of the cellular components into a new 1.5 milliliter tube labeled as Cytosol. Remove the tube containing isolated Phagosomes from the rack and re-suspend in one milliliter sterile PBS.Place the tube back on the magnetic rack for five minutes and then remove the PBS. After repeating this washing with PBS once, remove the PBS and finally, re-suspend S.Typhimurium containing Phagosomes in the required buffer. To assess effectiveness of S.Typhimurium Biotinylation by confocal microscopy, BMDMs were infected with mCherry S.Typhimurium labeled with Biotin.After fixation and incubation with Cy5-Streptavidin, successful Biotinylation was confirmed by Cy5-Streptavidin fluorescent signal. This signal was observed exclusively in Biotinylated mCherry S.Typhimurium whereas there was no signal in not Biotinylated mCherry S.Typhimurium. Immunoblock analysis of isolated Phagosomes showed significant enrichment of mCherry expressing S.Typhimurium in Phagosomes in comparison to the cytosolic fraction.Immunoblock analysis using endosome and lysosome markers in isolated Phagosomes showed enrichment of the tested markers in Phagosomes isolated four hours after infection compared to 30 minutes after infection. When this protocol was applied to Staphylococcus aureus, successful Biotinylation of GFP expressing S.aureus was shown. Once mastered, this technique can be done in approximately one hour and a half depending on the incubation time chosen for infection by the investigator.To ensure the success of the isolation of bacteria containing Phagosomes, please make sure that the buffers contain the indicated concentrations and that the plates are rocked to ensure the homogeneous coverage of the cells. Also, be gentle when scraping the cells and when passing the cell suspension through the needle. Following this procedure, other techniques such as proteomics or metabolomics can be performed with isolated Phagosomes to study alteration caused by pathogens under pathogenic factors involved.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay om Phenotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualiseren Non-lytische Exocytosis van<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...