Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

מחקר במעבדה של רובינסון הוא נתמך על ידי מימון מהאשכול מצוינות קלן על תגובות הלחץ הסלולר במחלות Aging-Associated, אוניברסיטת קלן, גרמניה (CECAD; במימון של DFG בתוך יוזמה מצוינות של הפדרלי הגרמני, המדינה ממשלות) ומענקים פתוח (SFB 670), הון קלן, מריה-Pesch יסודות אוניברסיטת קלן, גרמניה.

כל השלבים הכרוכות של פתוגניים ס typhimurium צריך להתבצע BSL-2 או גבוה יותר מתקן רמת אבטחה ביולוגי. התרבות ואת ציפוי של ס Typhimurium, כמו גם את הזיהום של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) חייב להתבצע תחת תא למינארי למניעת זיהום. בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes יכול להתבצע על כל ספסל מ?...

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

שיטה חדשה עבור בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes על-ידי ציפוי החיידק ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי מתואר כאן. לאחר הפרעה עדין של קרום התא, phagosomes המכיל חיידקים ניתן בקלות לחלץ באמצעות מתלה מגנטי. אנו מראים כי תיוג של החיידקים המשמרת את הקיבולת של המחלה כדי לגרום לדלקת, אינה משנה את ה?...

המקרופאגים הם מסתובבים תאים phagocytic מיוחדים לזהות, לבלוע, לבזות את כל החלקיקים הזרים נוכח ברקמות היקפיים, החל מוות תאים כדי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים פולשים. על פני השטח קולטן בתיווך זיהוי של סמנים הפתוגן הספציפי הנוכחי בדרך כלל על פני השטח של מיקרואורגניזמים (המכונה פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרי או PAMPs), מקרופאגים ליזום ומורכב של הממברנה התאית ב סדר כדי להקיף את הפתוגן1phagocytize.
הפתוגן אפף נכלל אז על ידי מקרופאג ב שלפוחית תאיים המכונה phagosome. דרך סדרה של פיוז'ן ואירועים ביקוע עם שלפוחית אחרים כגון endosomes ו- lysosomes, phagosome פתוגן המכיל רוכש ערכה של חלבונים הדרושים עבור חיסול של התוכן phagosomal. לכן, ההרכב אנזימטי של phagosome זה משתנה מאוד במהלך תהליך זה, המכונה ההבשלה phagosome2.
זמן קצר לאחר phagocytosis, multimeric ATPase vacuolar מורכבים (v-ATPase) הוא שולב קרום phagosome על ידי היתוך עם endosomes3. מתחם זה מנצל ATP כדי משאבת הפרוטונים מ ציטוזול כדי לומן של phagosome4. לחומצי phagosome חיוני עבור האירועים פיוז'ן עם אחרים שלפוחית5 , הפעלת מספר רב של אנזימים degradative תלויי-pH6. עוד מתחם אנזימטי multimeric במהירות שמתארגנת על קרום phagosome הוא המתחם nadph לאוקסידאז (NOX). NOX מורכבים מתחמצן nadph על מנת לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) זה מופרשים לתוך לומן phagosome ואשר תורמות באופן משמעותי הריגתו של מיקרואורגניזמים אפף7.
במהלך השלבים הראשונים של התבגרות, phagosomes להציג סמני בדרך כלל כגון Rab5 ו- Rab7 של endosomes מוקדמות ומאוחרות בהתאמה יחד עם יחידת משנה0 V של v-ATPase8. פיוז'ן של phagosomes עם lysosomes ו- endosomes מאוחר תוצאות חשיפת המחלה phagocytized למגוון רחב של אנזימים hydrolytic כגון cathepsin פרוטאזות, lipases וβ-galactosidase9. לחומצי לומן נדרש גם ההפעלה של אנזימים אלה. לדוגמה, המחשוף של cathepsin D כדי לייצר טופס קצר פעיל הוא תלוי-pH10. אנזימים אלה לבזות את הפתוגן ולסיים את הייצור של פפטידים קצרים, נגזר הפתוגן מוצגים על ידי מקרופאג histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II מולקולות בתאי T כדי לעורר תגובה חיסונית אדפטיבית11.
לפיכך, phagosome ההבשלה הוא קריטי עבור התגובה החיסונית מולדת וקישורים הזרועות מולדת, גמישים של המערכת החיסונית. . זה לא מפתיע כי פתוגנים התפתחו אסטרטגיות כדי להתגבר על חיסול על ידי מקרופאגים לאורך התהליך המתואר לעיל של התבגרות phagosome... לדוגמה, החיידק תאיים שחפת Mycobacterium , הלגיונלה pneumophila למנוע ההבשלה phagosome על ידי מעכבים v-ATPase הרכבה ו לומן הסוגר acidification12,13 . חיידקים אחרים, כגון ליסטריה או שיגלה flexneri זירוז היווצרות נקבובית ממברנה phagosome להימלט אל ציטוזול ה-14,15. לעומת זאת, serovar enterica סלמונלה typhimurium (S. typhimurium) הוא מסוגל לשנות את המאפיינים של phagosome בתוך חלולית להפכו במיקום מתאים עבור שכפול שלו16. יכולת זו גורם S. typhimurium מודל מאוד מעניין ללמוד בתיווך הפתוגן הפרעה של התבגרות phagosome.
ס typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, ס חיידקים Typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הנכלל phagosomes17. כמה דיווחים בעבר תיארו את ס typhimurium-phagosomes המכיל להציג למקבלי הן endosomes והן lysosomes18, מחקרים אחרים מצאו ליזוזום phagosome פיוז'ן מנעה על ס זיהום Typhimurium19.
בתחילה, phagosome ההבשלה על ס זיהום typhimurium נחקר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. התפתחות טכניקות בידודו של המכילים חיידקים phagosomes התומך מחקר מדויק יותר של התוכן phagosome במונחים של סמנים אנדוזום, ליזוזום. נכון להיום, שיטת העיקרי המשמש את ניתוקה של המכילים חיידקים phagosomes הוא fractionation subcellular18,מעברי צבע של סוכרוז שלב20. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר השלבים צנטריפוגה זה יכול לגרום לנזק מכני phagosomes, יכול להשפיע על היציבות של רכיבים phagosomal (חלבונים ושומנים), הוא זמן רב. יתר על כן, זה דורש את השימוש ultracentrifuge: פיסת ציוד מיוחד שאינו נגיש עבור כל מעבדה.
לאחרונה הוחל גישה חדשה את בידודה של בקטריאלי המכיל phagosomes, שבו פתוגנים חיידקיים מסומנות עם biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ומאוחר יותר חילוץ באמצעות streptavidin מצומדת beads מגנטי21 . אנו מציעים שיטה משלימה חלופית על-ידי תיוג חיידקי משטח המכיל amine מקרומולקולות עם NHS-ביוטין ואחריו streptavidin מצומדת beads מגנטי. Phagosomes המתקבלות בשיטה זו מאוד מועשרים בסמני אנדוזום, ליזוזום והוא יכול לשמש למגוון רחב של מבחני, מניתוח חלבון טכנולוגיות לניתוח. בנוסף, זה אינו מצריך ציוד מיוחד כגון ultracentrifuges. יתר על כן, על ידי ביטול השלבים צנטריפוגה, הנזק מכני phagosomes והן את כמות הזמן המועסקים הם מופחת במידה ניכרת. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של phagosomes המכילה חיידקים אחרים, כגון גראם חיוביים Staphylococcus aureus, כללה גם כתב יד זה. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes הוא משחק פשוט, חסכוני, חינוך, פחות זמן רב יותר הבידוד קלאסית מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation, עיבוד מאוד המכיל חיידקים phagosomes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

סלמונלה typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, S. חיידקים typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הכלול שלפוחית המכונה phagosomes על מנת להיות מושפל. בידוד של ס typhimurium-phagosomes המכיל היה בשימוש נרחב כדי ללמוד איך ס זיהום typhimurium משנה את תהליך ההבשלה phagosome כדי למנוע השפלה חיידקי. באופן קלאסי, בידודו של המכילים חיידקים phagosomes בוצעה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. עם זאת, תהליך זה זמן רב, דורש מידה מסוימת של מיומנות וציוד מיוחדים. המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ומהירה על בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין-streptavidin-מצומדת beads מגנטי. יכול להיות מושעים phagosomes המתקבלות בשיטה זו כל מאגר של בחירה, המאפשר הניצול של phagosomes מבודדים למגוון רחב של מבחני, כגון חלבון, מטבוליט ו ליפיד לניתוח. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes ספציפיים, יעיל, מהיר, דורש ציוד מינימלי, תכליתי יותר מאשר השיטה הקלאסית של בידוד מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation.

בידוד של המכילים חיידקים phagosomes על ידי פרוטוקול זה מחייב את biotinylation של החיידקים כצעד ראשון. אנחנו ולכן העריך את האפקטיביות של ס typhimurium biotinylation על ידי ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית BMDMs נגוע biotinylated mCherry -S. typhimurium המסומנת Cy5-Streptavidin. בקצרה, BMDMs נדבקו כפי שמתואר פ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...