Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00
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Pesquisa no laboratório de Robinson é suportada pelo financiamento do Cluster de excelência Colónia na resposta de estresse celular em doenças Aging-Associated, Universidade de Colónia, Alemanha (CECAD; financiado pelo DFG no quadro da iniciativa de excelência da federal alemão e os governos do estado) e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria Pesch Fundação da Universidade de Colónia, Alemanha.

todas as etapas que envolvam a utilização de patogenicidade S. typhimurium deve ser efectuada em BSL-2 ou superior unidade de nível de segurança biológica. A cultura e o revestimento do S. Typhimurium, bem como a infecção de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) deve ser realizada sob uma capa de fluxo laminar para evitar a contaminação. O isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes pode ser executada em qualquer bancada de laboratório BSL-2.
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	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. 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G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

Um novo método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos é descrito aqui. Após suave rompimento da membrana celular, que contêm bactérias phagosomes podem ser facilmente extraídos usando um rack magnético. Mostramos que a rotulagem das bactérias preserva a capacidade do patógeno para induzir a inflamação e não altera a propriedade fagocítica da célula hospedeira. Importante, phagosomes o...

Os macrófagos estão circulando em células fagocíticas especializadas que detectam, englobam e degradam qualquer partícula estranha presente em tecidos periféricos, variando de pilhas apoptotic a invadir microorganismos tais como bactérias. Em cima da superfície mediada reconhecimento de marcadores específicos do patógeno comumente presentes na superfície dos microorganismos (conhecido como patógeno associado a padrões moleculares ou PAMPs), macrófagos iniciar uma complexa reorganização da membrana celular em fim de cercar e phagocytize o patógeno1.
O patógeno tragado então contido pelo macrófago em uma vesícula intracelular denominada fagossomo. Através de uma série de fusão e fissão eventos com outras vesículas como endossomos e lisossomos, o patógeno contendo fagossoma adquire um conjunto de proteínas necessárias para a eliminação do conteúdo phagosomal. Portanto, a composição enzimática do fagossomo é altamente variável no decurso deste processo, conhecido como fagossoma maturação2.
Logo após a fagocitose, a complexo ATPase vacuolar (v-ATPase) da membrana do fagossomo é incorporada por fusão com endossomos3multiméricas. Este complexo utiliza ATP para bombear protões do citosol para o lúmen do fagossoma4. Acidificação do fagossomo é essencial para os eventos de fusão com outras vesículas5 e para a ativação de um grande número de enzimas degradativos dependente do pH6. Outra multiméricas complexo enzimático que é rapidamente montado na membrana do fagossomo é o complexo NADPH-oxidase (NOX). NOX complexo oxida NADPH para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que são segregadas para o lúmen do fagossoma e que contribuem significativamente para a matança do tragado microorganismos7.
Durante os passos iniciais da maturação, phagosomes apresentar marcadores normalmente como Rab5 e Rab7 de endossomos cedo e tarde, respectivamente, juntamente com a subunidade de0 V do v-ATPase8. Fusão de phagosomes com lisossomos e tarde endossomos resulta na exposição do patógeno fagocitada para uma grande variedade de enzimas hidrolíticas, como proteases catepsina, lipases e β-galactosidase9. Acidificação do lúmen é também necessária para a ativação destas enzimas. Por exemplo, a clivagem de catepsina D para produzir o formulário curto ativo é dependente do pH10. Essas enzimas degradam o patógeno e mediam a produção de derivados de patógeno peptides curtos que são apresentados pelas macrófago histocompatibilidade (MHC) classe II moléculas complexas de células T para desencadear uma resposta imune adaptativa11.
Daí, maturação do fagossoma é crucial para a resposta imune inata e links braços do sistema imune inatos e adaptativos. Não é nenhuma surpresa que os patógenos desenvolveram estratégias para superar a eliminação por macrófagos pelo processo de maturação do fagossoma acima descritas. Por exemplo, a bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis e Legionella pneumophila impede a maturação do fagossoma inibindo v-ATPase assembly e o lúmen consequente acidificação12,13 . Outras bactérias, como a Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induzem a formação de poros na membrana do fagossomo de escapar para o citosol14,15. Por outro lado, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é capaz de modificar as propriedades do fagossomo dentro do vacúolo para transformá-lo em um local adequado para a sua replicação16. Esta habilidade faz S. typhimurium um modelo muito interessante para estudar a interferência mediada por patógeno de maturação do fagossoma.
S. typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S. Typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em phagosomes17. Alguns relatos têm descrito anteriormente que S. typhimurium-contendo phagosomes fabricantes para ambos os endossomos e lisossomos18do presente, e outros estudos encontraram fusão fagossoma-lisossoma prevenida sobre S. Typhimurium infecção19.
Inicialmente, maturação de fagossoma com S. typhimurium infecção foi investigada por microscopia de imunofluorescência. O desenvolvimento de técnicas para o isolamento de bactérias contendo phagosomes habilitado para um estudo mais preciso do conteúdo do fagossoma em termos de marcadores endossomo e lisossomo. Até à data, o principal método usado para o isolamento de bactérias contendo phagosomes é o fraccionamento subcelular em sacarose passo gradientes18,20. No entanto, este método requer várias etapas de centrifugação que podem causar danos mecânicos ao phagosomes, podem afetar a estabilidade dos componentes phagosomal (proteínas e lipídios) e é demorado. Além disso, exige o uso de um se: um pedaço de equipamento especializado que não é acessível para todos os laboratórios.
Recentemente, uma nova abordagem foi aplicada para o isolamento de bactérias contendo phagosomes, em que os patógenos bacterianos são rotulados com lipopetide biotinilado (Lipobiotin) e mais tarde extraído usando grânulos magnéticos estreptavidina conjugada21 . Propomos um método alternativo complementar através da marcação de macromoléculas contendo amina superfície bacterianas com NHS-biotina seguido por grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Phagosomes obtidos por esse método são altamente enriquecidos em marcadores endossomo e lisossoma e podem ser usados para uma ampla gama de ensaios, de análise de proteínas para análise omics. Além disso, não requer equipamento especializado como ultracentrifuges. Além disso, eliminando as etapas de centrifugação, tanto os danos mecânicos à phagosomes e a quantidade de tempo empregado são consideravelmente reduzidos. Esse método pode ser facilmente adaptado para o isolamento de phagosomes contendo outras bactérias, tais como o Gram-positivas Staphylococcus aureus, também incluído neste manuscrito. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é um simples, econômico, e menos demorada do que a clássico isolamento por sacarose gradiente-ultracentrifugação, tornando-se altamente enriquecido contendo bactérias phagosomes.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S.. typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em vesículas, conhecidas como phagosomes, a fim de ser degradado. Isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes têm sido amplamente utilizados para estudar como S. typhimurium infecção altera o processo de maturação do fagossoma para prevenir a degradação bacteriana. Classicamente, o isolamento de bactérias contendo phagosomes foi executada por centrifugação gradiente de sacarose. No entanto, esse processo é demorado e requer equipamento especializado e um certo grau de destreza. Descrito aqui é um método simples e rápido para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com grânulos magnéticos estreptavidina-biotina-conjugados. Phagosomes obtidos por esse método podem ser suspenso em qualquer reserva de escolha, permitindo a utilização de phagosomes isolados para uma ampla gama de ensaios, tais como análise de proteínas, metabólito e lipídios. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é rápida, eficiente e específico, requer equipamento mínimo e é mais versátil do que o método clássico de isolamento por gradiente de sacarose-ultracentrifugação.

Isolamento de bactérias contendo phagosomes pelo presente protocolo requer o biotinylation das bactérias como um primeiro passo. Avaliamos, portanto, a eficácia da S. typhimurium biotinylation por análise de microscopia confocal de BMDMs infectados com biotinilado mCherry -S. typhimurium rotulado com Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs foram infectados conforme descrito neste protocolo com mCherry -S. typhimurium biotinilado ante...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Imunologia e Infecção

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

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Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

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De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...