Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Исследования в лаборатории Робинсон поддерживается финансирование из Кельна Excellence кластера на клеточных реакций стресс в Aging-Associated заболеваниях, Кёльнского университета, Германия (CECAD; финансируемых DFG в рамках инициативы превосходство немецкого федерального и Государственный правительства) и гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune и Мария-Pesch фонд университета Кельна, Германия.

все шаги, связанные с применением патогенных S. typhimurium должны осуществляться в BSL-2 или выше учреждения уровня биологической безопасности. Культура и покрытие S. Typhimurium, а также инфекции костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) должны быть выполнены под Ламинарный шкаф дл?...

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

Новый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes, покрывая бактерий с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы описано здесь. После нежный нарушения клеточной мембраны бактерии содержащих phagosomes могут быть легко извлечены с помощью магнитной стойке. Мы показы...

Макрофаги являются циркулирующие специализированных фагоцитирующих клеток, которые обнаружить, поглотит и ухудшить любые иностранные частиц, присутствующих в периферических тканях, начиная от apoptotic клеток до вторжения микроорганизмов, таких как бактерии. После поверхности рецептор опосредованный признания возбудителя определенных маркеров обычно присутствует на поверхности микроорганизмов (известный как патоген связанные молекулярные структуры или PAMPs) макрофаги инициировать сложный реорганизации клеточной мембраны в для того, чтобы окружить и фагоцитируют возбудителя1.
Охватившего патогена, затем содержится макрофагов в внутриклеточного везикул, известный как фагосомы. Через серию слияние и деление события с другими везикулы, таких как endosomes и лизосом возбудитель содержащих фагосомы приобретает набор белков, необходимых для ликвидации phagosomal содержание. Таким образом в ходе этого процесса, известный как фагосомы созревания2состав ферментативных фагосомы крайне непостоянны.
Вскоре после фагоцитоза, multimeric, которую комплекс вакуолярной АТФаза (v АТФаза) включена в мембране фагосомы сплавливанием с endosomes3. Этот комплекс использует АТФ для перекачки протонов от цитозоль для люмен фагосомы4. Подкисление фагосомы имеет важное значение для события слияния с другими везикулы5 и для активации большое количество рН зависимых ферментов и деструктивные6. Другой multimeric энзимный комплекс, который быстро собрал на мембране фагосомы представляет собой комплекс NADPH-оксидазы (NOX). NOX комплекс окисляет NADPH произвести реактивнооксигенных видов (ров), выделяется в просвете фагосомы и что существенный вклад в убийстве охватившего микроорганизмов7.
На первоначальных этапах созревания phagosomes настоящее время маркеры обычно как Rab5 и Rab7 раннего и позднего endosomes соответственно наряду с Субблок0 V v АТФазы8. Слияние phagosomes с лизосом и позднего endosomes приводит к подверженности самые разнообразные гидролитические ферменты, такие как катепсин протеаз, липазы и β-галактозидазы9фагоцитированных возбудителя. Подкисление просвета также необходим для активации этих ферментов. Например расщепление катепсина Д производить активный короткая форма-рН зависимых10. Эти ферменты ухудшить возбудителя и посредником производства возбудителя производные короткие пептиды, которые представлены макрофагов гистосовместимости комплекс (MHC) класса II молекул клеток T, чтобы инициировать адаптивного иммунного ответа11.
Следовательно фагосомы созревания имеет решающее значение для врожденный иммунный ответ и связывает врожденного и адаптивного герб иммунной системы. Это не удивительно, что патогенные организмы развивались стратегии преодоления ликвидации макрофагами через описанные выше процесс созревания фагосомы. Например внутриклеточных бактерий микобактерии туберкулеза и Legionella pneumophila предотвратить созревание фагосомы ингибирующих v АТФазы Ассамблеей и последующего люмен подкисления12,13 . Другие бактерии, такие как Listeria monocytogenes или шигеллам Флекснера побудить порообразования в мембране фагосомы бежать в цитозоль14,15. С другой стороны, Salmonella enterica серовар typhimurium (S. typhimurium) имеет возможность изменить свойства фагосомы в вакуоль превратить его в подходящее место для его репликации16. Эта способность делает S. typhimurium очень интересная модель для изучения возбудителя опосредованной вмешательства фагосомы созревания.
S. typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. Typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащихся в phagosomes17. В некоторых докладах ранее описал что S. typhimurium-содержащих phagosomes настоящее время производители для endosomes и лизосом18, и другие исследования обнаружили фагосомы Лизосома фьюжн, предотвратить после S. Typhimurium инфекции19.
Первоначально фагосомы созревания на S. typhimurium инфекции были расследованы иммунофлуоресценции. Разработка методов для изоляции бактерий содержащих phagosomes включено более точное исследование содержания фагосомы с точки зрения endosome и лизосомальных маркеров. На сегодняшний день, основной метод, используемый для изоляции бактерий содержащих phagosomes является субцеллюлярные фракционирование сахарозы шаг градиенты18,20. Однако этот метод требует несколько шагов центрифугирования, которые могут вызвать механические повреждения phagosomes, может повлиять на стабильность phagosomal компонентов (белков и липидов) и отнимает много времени. Кроме того, он требует использования ультрацентрифуга: кусок специализированного оборудования, который не доступен для каждой лаборатории.
Недавно, новый подход был применен к изоляции бактериальных содержащих phagosomes, в которых бактериальных патогенов помечены с биотинилированным lipopetide (Lipobiotin) и впоследствии извлечены с помощью конъюгированных стрептавидина магнитные бусы21 . Мы предлагаем альтернативный дополнительный метод, снабдив бактериального поверхности Амин содержащих макромолекул с ГСЗ-биотин следуют конъюгированных стрептавидина магнитные шарики. Phagosomes, полученные этим методом сильно обогащенный в endosome и лизосомальных маркеры и может быть использован для широкий спектр анализов, от анализа белка омику анализа. Кроме того она не требует специализированного оборудования, такого как Ультрацентрифуги. Кроме того устраняя шаги центрифугирования, механические повреждения phagosomes и количество времени, занятых значительно сокращаются. Этот метод может быть легко адаптирована для изоляции phagosomes, содержащие другие бактерии, такие как грамположительных Staphylococcus aureus, также включены в этой рукописи. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes является простым, экономически эффективным, и меньше времени чем классической изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation, оказание высоко обогащенного бактерий содержащих phagosomes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Сальмонеллы typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащиеся в везикулы, известный как phagosomes для того чтобы быть понижена. Изоляция S. typhimurium-содержащих phagosomes широко использовался для изучения как S. typhimurium инфекции изменяет процесс созревания фагосомы для предотвращения бактериального деградации. Классически, изоляции бактерий содержащих phagosomes была выполнена, сахароза градиентного центрифугирования. Однако этот процесс занимает много времени и требует специализированного оборудования и определенная степень ловкости. Описанные здесь — это простой и быстрый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина стрептавидина конъюгированных магнитные бусы. Phagosomes, полученные этим методом может быть приостановлено в любом буфере выбор, позволяя использование изолированных phagosomes для широкого спектра анализов, таких, как анализ белков, метаболит и липидов. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes конкретных, эффективных, быстрых, требует минимального оборудования и более универсальным, чем классический метод изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation.

Изоляция бактерий содержащих phagosomes этот протокол требует biotinylation бактерий в качестве первого шага. Поэтому мы провели оценку эффективности S. typhimurium biotinylation конфокальная микроскопия анализ BMDMs, инфицированных биотинилированным mCherry -S. typhimurium помечен...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Мы опишем здесь простой и быстрый метод для изоляции Salmonella typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина и стрептавидина.

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Визуализация Номера для литическую экзоцитоза<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Хроническая инфекция сальмонеллы индуцированных кишечный фиброз

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...