Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر مجلس البحوث السويدية (349-2007-8680) للتمويل و Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors، السويد) للتبرع بالغدد الكظرية الأبقار.

1-خلية ثقافة من الخلايا تشرومافين البقري معزول بواسطة الهضم الأنزيمي من الغدد الكظرية
<ol><li>لعزل خلايا تشرومافين التي تم جمعها من الغدد الكظرية الأبقار، تعقيم الخلايا مع محلول إيثانول 70%. تقليم الدهون بعيداً والنسيج الضام استخدام مشرط. لإزالة الدم، شطف الأوردة الكظرية استخدام حل لوك (مم 154...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

نقدم هنا بروتوكولا ومزايا الجمع بين ثلاثة أساليب تحليلية تكميلية لتحليل الحويصلات الافرازية وعملية الرقابة للحصول على فهم أفضل لكيف يمكن أن يؤثر على قوة مادية مثل الضغط التناضحي الحويصلات الافرازية وفي عملية الرقابة في الخلايا الافرازية. وتشمل هذه الأساليب أمبيروميتري ميكروليكترودي أ?...

الخلايا تشرومافين في الغدد الكظرية هي خلايا الغدد الصم العصبية أن الإفراج عن جزيئات الناقل العصبي في مجرى الدم. وهذا يحدث من خلال عملية الخلوية التي تنطوي على الالتحام والانصهار من حويصلات مملوءة بالعصبي، أسفرت عن الإفراج عن المحتوى من الحويصلات إلى الفضاء خارج الخلية في عملية تسمى الرقابة. العصبية (الأدرينالين ونورادرينالين) في الخلايا تشرومافين بنشاط تنقل عن طريق بروتينات الغشاء إلى حويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (لدكفس) وتخزينها في تركيزات عالية (~0.5-1 م)1،2. يتم إنجاز تراكم العصبية داخل لدكفس بتقارب جزيئات الكاتيكولامينات إلى مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة إينترافيسيكولار تتألف من تشروموجرانين البروتينات (~ 169 ملغ/مل)3،4،5 ،6، وحلا كوكتيل إينترافيسيكولار الذي يحتوي على المكونات الرئيسية لتخزين وتحميل الكاتيكولامينات إلى حويصلة مثل ATP (125-300 مم)7، Ca2 + (50-100 ميكرومتر في الحل ومم ~ 40 ملزمة مصفوفة البروتين)8، Mg2 + (5 ملم)9، اسكوربات (10-30 ملم)10، والرقم الهيدروجيني من ~5.511،12. لدكفس الحفاظ على شرط iso ناضح الخلية السيتوبلازم (310 موسم/كغ)13، على الرغم من أن تركيز ذائبة النظرية داخل الحويصلات مبلغ يصل إلى أكثر من 750 ملم. تكوين المكونات إينترافيسيكولار ليست فقط ضرورية لتحميل وتخزين الكاتيشولامين، ولكن أيضا لتجميع الذوائب لمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة. وهذا يقلل كثيرا من الاسموليه الحويصلات انخفض انخفاضا كبيرا، ويمكن أن تؤثر على الكاتيكولامينات المبلغ تم إصداره من خلال الرقابة5،6.
وأفادت الدراسات عن تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة عن طريق تسجيل أمبيروميتريك أن ارتفاع الضغط الاسموزي خارج الخلية يحول دون نشاط الرقابة، ويقلل من العدد من أجهزة الإرسال العصبية ويفرز من واحد حويصلة المقصورات4،،من1415،16،17،،من1819. تكهنت التفسيرات لهذه الملاحظات على تعزيز إمكانية مزاحمة الجزيئات في أحداث الانصهار حويصلة المثبطة الخلية السيتوبلازم، وتغيير في غشاء الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على عدد أجهزة الإرسال العصبية صدر خلال الرقابة. هذه الأفكار يفترض أن ارتفاع الضغط التناضحي خارج الخلية لا يؤثر على حجم حويصلة كانتال، الذي يحدد عدد جزيئات العصبي المخزنة في حجرة حويصلة في المرحلة السابقة للرقابة المشغلة14، 15 , 17 , 19 , 20 , 21-في القياسات أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة في الخلايا المفردة، يوضع ميكروليكترودي قرص ألياف الكربون في اتصال وثيق مع سطح الخلية، إنشاء مجموعة تجريبية حتى محاكاة التكوين المشبك، حيث أمبيروميتريك بمثابة القطب22،بوستسينابتيك كاشف (الشكل 1)23. عن طريق تنشيط خلية للرقابة، واحد يمكن أن يستحث حويصلات مملوءة العصبي تلتحم مع غشاء بلازما الخلية والإفراج عن جزء أو محتوى حويصلة كاملة في الفضاء خارج الخلية. يمكن اكتشاف هذه الجزيئات العصبي صدر على سطح القطب اليكتروتشيميكالي العصبية في حالة اليكترواكتيفي (مثلاً، الكاتيشولامين) بتطبيق محتملة الأكسدة + 700 مقابل أم قطب مرجعي Ag/AgCl . ونتيجة لذلك، سلسلة من المسامير الحالية مناسبة الكشف عن أحداث الرقابة الفردية. من الحالي مقابل تتبع الوقت في تسجيل أمبيروميتريك بالمنطقة تحت كل سبايك أمبيروميتريك واحد يمثل المسؤول عن الكشف عن كل حدث الرقابة ويمكن تحويلها إلى الخلد العصبية في إصدارها، باستخدام المعادلة فاراداي. ومن ثم، تسجيلات أمبيروميتريك تقديم معلومات كمية عن العصبية المبلغ طردوا من أحداث الرقابة واحد وتقرير عن تواتر الأحداث الرقابة، لكن لا تقدم معلومات كمية عن الحويصلات الافرازية المحتوى قبل بدأ الإفراج عن الانصهار والعصبي حويصلة.
ولذلك، للحصول على فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف في الخلية السيتوبلازم يستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية قبل أن يتم تشغيل الخلية على الخضوع للرقابة، يمكن استخدام أساليب تحليلية تكميلية أخرى لإثراء هذه المعلومات. على سبيل المثال، للتحقيق في حالة الإجهاد ناضح يغير حجم حويصلة، يمكن استخدام مجهر إلكتروني (TEM) التصوير تحليل لقياس حجم حويصلة من الخلايا بعد التثبيت الكيميائي. لفحص حالة الإجهاد ناضح يؤثر حجم حويصلة كانتال، يمكن تطبيق تقنية أمبيروميتريك المتقدمة مؤخرا تسمى الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، للتحديد الكمي لمحتوى العصبي حويصلة في الحويصلات الافرازية في هذه الدولة الأصلية عند الذين ما زالوا يقيمون في السيتوبلازم للخلايا الحية26. في تقنية الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يتم إدراج قطب أسطواني ألياف الكربون نانوتيب برفق في السيتوبلازم للخلايا الحية، وعن طريق تطبيق محتملة أم + 700 لهذا القطب (مقابل Ag/AgCl مرجع قطب كهربائي)، محتوى الكاتيكولامينات في حويصلات يمكن قياسها كمياً بالكشف عن طفرة الأكسدة الحالية من حويصلات وحيد الاصطدام، أدسوربينج، ويمزق بعد ذلك ستوتشاستيكالي على سطح القطب وثم الإفراج عن محتوياتها ضد القطب السطحية26. ومن ثم في أمبيروميتريك الحالية مقابل تتبع الوقت، كل حدث rupturing حويصلة واحدة يمكن أن ينتج عابرة الحالية وعن طريق إدماج مجال كل المصطلحات الحالية، يمكن حساب حجم قوانتال حويصلة استخدام القانون Faraday´s.
ولذلك، من خلال ربط المعلومات الكمية المكتسبة من قياسات حجم حويصلة استخدام التصوير تيم جنبا إلى جنب مع تحليل حجم كانتال حويصلة، كما سجلتها الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، حويصلة العصبي تركيز يمكن أيضا يجب تحديد. وهذا يسمح توصيف حويصلة عندما تتعرض الخلايا لمختلف الظروف ناضح ويعطي فكرة أفضل عن كيفية حويصلات قد تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية في المرحلة قبل الرقابة. وقد أظهرت النتائج من الجمع بين هذه الأساليب أن حضور الضغط الاسموزي العالي خارج الخلية، حويصلات تقليص وضبط حجمها كانتال، ومقارنة المعلومات الكمية المتعلقة بالتغيرات النسبية من هذه القياسات تبين أن بينما تتقلص، حويصلات ضبط محتوياتها والحجم للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. وهكذا، هذا الفهم القيمة في الاتصال بالملاحظات التي أبديت على إطلاق سراح العصبي في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي. في هذه البروتوكولات، يصف لنا استخدام هذه ثلاث منهجيات متكاملة تسمح بتوصيف الحويصلات الافرازية كيف في الرد على البيئة الأصلية ل osmolality خارج الخلية وآثار هذا الرد على الرقابة عملية. وبالإضافة إلى ملاحظاتنا السابقة فيما يتعلق بالتأثير ارتفاع الضغط الاسموزي على الرقابة24، نقدم المزيد من التجارب التي تصف خلية الإنعاش بعد صدمة ناضح وتأثير التحفيز الباريوم متعددة في تشرومافين الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

تسجيل أمبيروميتري الخلايا تعرض لصدمة ناضح وتبين أن الخلايا الافرازية تستجيب لهذا الإجهاد البدني بالحد من نشاط الرقابة ومقدار العصبي صدر من حويصلات في أحداث الرقابة واحدة. ويقترح أن يرجع الانخفاض في العصبية طرد تغييرات في الخصائص الفيزيائية الغشاء عند تقليص الخلايا في استجابة للضغط ناضح ومع الافتراضات التي لا تتأثر الحويصلات الافرازية في السيتوبلازم الخلية بالضغط التناضحي خارج الخلية. تسجيل أمبيروميتري للرقابة ترصد ما أطلق سراحه من الخلايا في الوقت الحالي حويصلة الصمامات مع غشاء البلازما، ولكن عدم تقديم معلومات عن محتوى حويصلة قبل أن يتم تشغيل الانصهار حويصلة. ولذلك، يوفر التسجيل مع أساليب أخرى تحليلية متكاملة قادرة على وصف الحويصلات الافرازية قبل أن يتم تشغيل الرقابة على الخلايا عن طريق الجمع بين أمبيروميتري نظرة أوسع لدراسة الحويصلات الافرازية كيف تتأثر عملية الرقابة بصدمة ناضح. ونحن هنا تصف كيف يمكن استخدام تكملة أمبيروميتري تسجيل مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) تصوير لوصف التغييرات في محتوى الحويصلات الافرازية الحجم والعصبي في تشرومافين الخلايا بالنسبة لنشاط الرقابة قبل وبعد التعرض للضغط التناضحي. عن طريق ربط المعلومات الكمية المكتسبة من تجارب باستخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث، قدمت استنتاجات سابقا أن الحويصلات الافرازية تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية بالتقلص في الحجم وتقليل حجم حويصلة كانتال إلى الحفاظ على تركيز عصبي حويصلة مستمر. ومن ثم، وهذا يعطي بعض التوضيحات بشأن لماذا حويصلات، في استجابة للضغط التناضحي، تقليل العصبية المبلغ صدر خلال الإفراج عن الرقابة. تسجيلات أمبيروميتريك هنا تشير إلى هذا هو عملية عكسية وأن حويصلة بعد صدمة ناضح يتم تعبئتها بالعصبية عندما يتم إعادة وضع الخلايا في بيئة متساوي التوتر.

ونحن هنا وصف البروتوكول لكيفية الجمع بين تصوير تيم جنبا إلى جنب مع اثنين من منهجيات الكهروكيميائية، أمبيروميتري ألياف الكربون والخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يمكن أن توفر المعلومات التي تكتسب رؤية أوسع نطاقا في إشارة إلى تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة والحويصلا...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقابة.

رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

الضغط المنخفض الطريق التعلم عن طريق المتاهة الثالث لاشلي في الفئران

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

تصوير الدماغ التحقيق تأثير الذاكرة تعزيز العاطفة

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

تصوير الدماغ التحقيق الإضعاف من تأثير العاطفة على الإدراك

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

النمذجة اشارة المناعة العصبية من الصداع النصفي العرضية والاكتئاب المزمن عن طريق نشر في المختبر</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

تسريب التجسيمي من بلازميدة قليلة القسيمات اميلويد بيتا في الحصين ماوس

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

زرع مضخات التناضح والحث على الإجهاد لإنشاء أعراض, نموذج الماوس الدوائية لDYT/PARK-ATP1A3 خلل التوتر

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

توصيل الدواء القائم على المضخة الأسموزية لأبحاث إعادة الميالين في الجسم الحي على الجهاز العصبي المركزي

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...