Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

De auteurs bedank de Zweedse Onderzoeksraad (349-2007-8680) voor financiering en Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Zweden) voor donatie van boviene bijnieren.

1. de celcultuur van boviene Chromaffin cellen geïsoleerd door enzymatische spijsvertering van de bijnieren
<ol><li>Isoleren chromaffin cellen verkregen boviene bijnieren, steriliseren cellen met 70% ethanol oplossing. Trim weg vet en bindweefsel met behulp van een scalpel. Om het bloed te verwijderen, spoel de bijnier aderen met behulp van Locke's oplossing (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 5,6 mM met een pH van 7,4) die al waterbaden tot 37 ° C.</li>
	<li>Te...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Wij presenteren hier een protocol en de voordelen van de combinatie van drie elkaar aanvullende analytische methoden om secretoire blaasjes en het proces van exocytose te krijgen een beter begrip van hoe een fysieke kracht zoals osmotische druk secretoire blaasjes beïnvloeden kan te analyseren en het proces van exocytose in secretoire cellen. Deze methoden omvatten koolstofvezel micro-elektrode amperometry, die een gevestigde methode is voor het opnemen van exocytose activiteit, intracellulaire elektrochemische cytometr...

Chromaffin cellen in de bijnieren zijn neuro-endocriene cellen die release neurotransmitter moleculen in de bloedstroom. Dit gebeurt door een cellulaire proces waarbij de docking en de fusie van de neurotransmitter gevulde blaasjes, resulterend in de release van de inhoud van blaasjes aan de extracellulaire ruimte in een proces genaamd exocytose. De neurotransmitters (adrenaline en noradrenaline) in chromaffin cellen worden actief getransporteerd door membraaneiwitten in grote dichte kern blaasjes (LDCVs) en opgeslagen bij hoge concentraties (~0.5-1 M)1,2. Accumulatie van neurotransmitters in de LDCVs wordt bereikt door de affiniteit van catecholamine moleculen naar de intravesicular dichte kern eiwit matrix bestaat uit chromogranin eiwitten (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, en een intravesicular cocktail oplossing met belangrijke onderdelen voor catecholamine laden en opslag in het vesikel zoals ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in de oplossing en een ~ 40 mM gebonden aan de eiwit matrix)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbaat (10-30 mM)10en een pH van ~5.511,12. De LDCVs handhaven een iso-osmotische voorwaarde met de cel cytoplasma (310 mOsm/kg)13, hoewel de theoretische opgeloste concentratie binnen de blaasjes optellen tot meer dan 750 mm bedraagt. De samenstelling van de intravesicular componenten is niet alleen essentieel voor het laden en opslaan van catecholamines, maar ook voor samenvoeging van opgeloste stoffen naar de dichte kern eiwit matrix. Dit vermindert het installatieprogramma de osmolariteit van de blaasjes aanzienlijk verminderd en kan invloed hebben op het bedrag catecholamine die is uitgebracht tijdens exocytose5,6.
Studies over het effect van extracellulaire osmotische druk op het proces van exocytose door amperometrische opname hebben gemeld dat hoge extracellulaire osmotische druk remt exocytose activiteit en vermindert het aantal neurotransmitters uitgescheiden door één vesikel compartimenten4,14,15,16,17,18,19. De uitleg van deze opmerkingen hebben gespeculeerd over de mogelijke verbetering van macromoleculaire verdringing in de cel cytoplasma remmende vesikel fusion gebeurtenissen, en een wijziging in de membraan biofysische eigenschappen waardoor het aantal neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose. Deze gedachten verondersteld dat hoge extracellulaire osmotische stress niet afdoet aan het blaasje quantal formaat, waarin het aantal moleculen van de neurotransmitter opgeslagen in een blaasje compartiment voorafgaande stadium van geactiveerde exocytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in amperometrische metingen van exocytose release in afzonderlijke cellen, een koolstofvezel schijf micro-elektrode in nauw contact met het celoppervlak, maken een experimentele opgericht nabootsen van de configuratie van de synaps wordt geplaatst waar de amperometrische elektrode fungeert als een postsynaptisch detector (Figuur 1)22,23. Door het stimuleren van een cel exocytose, kan een neurotransmitter gevulde blaasjes te smelten met de celmembraan van plasma en vrijgeven van de volledige vesikel inhoud geheel of gedeeltelijk in de extracellulaire ruimte veroorzaken. Deze neurotransmitter moleculen vrijgegeven aan het oppervlak van de elektrode kunnen elektrochemisch worden gedetecteerd als de neurotransmitters electroactive (bijvoorbeeld, catecholamines zijn) door toepassing van een redoxpotentiaal meet van +700 mV vs een Ag/AgCl-elektrode . Daarom een aantal huidige spikes markeren de detectie van individuele exocytose gebeurtenissen. Van de huidige versus tijd traceren in een amperometrische-opname, het gebied onder elke één amperometrische spike vertegenwoordigt de lading per exocytose evenement gedetecteerd en kan worden geconverteerd naar het molletje van neurotransmitters uitgebracht, met behulp van de vergelijking van Faraday. Vandaar, de opnames amperometrische kwantitatieve informatie verschaffen over de hoeveelheid neurotransmitters verdreven uit één exocytose gebeurtenissen en verslag over de frequentie van exocytose gebeurtenissen, maar vertonen geen kwantitatieve informatie over de secretoire blaasjes inhoud voordat vesikel fusion en neurotransmitter release is ingeleid.
Dus, om een beter begrip van hoe secretoire blaasjes in de cel cytoplasma reageren op extracellulaire osmotische stress voordat de cel wordt geactiveerd om te ondergaan exocytose, andere aanvullende analytische methoden kunnen worden gebruikt om deze informatie te verrijken. Bijvoorbeeld, om te onderzoeken als osmotische stress vesikel volume verandert, kan transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) imaging analyse worden gebruikt voor het meten van het vesikel grootte van cellen na chemische fixatie. Om te onderzoeken of osmotische stress beïnvloedt vesikel quantal grootte, een techniek van de onlangs ontwikkelde amperometrische genaamd intracellulaire elektrochemische cytometry, kan worden toegepast voor de kwantificering van vesikel neurotransmitter inhoud op secretoire blaasjes in hun geboortestaat toen nog woonachtig in het cytoplasma van levende cellen26. In de intracellulaire elektrochemische cytometry techniek, een nanotip cilindrische koolstofvezel elektrode zachtjes wordt ingevoegd in het cytoplasma van levende cellen en door het toepassen van een potentieel +700 mV op deze elektrode (versus een Ag/AgCl referentie elektrode), de Catecholamine inhoud in blaasjes kan worden gekwantificeerd door de detectie van een redox huidige piek van enkele blaasjes botsen, adsorberend, en vervolgens stochastically te bezwijken aan de elektrode oppervlakte en daardoor het vrijgeven van hun inhoud tegen de elektrode oppervlakte26. Vandaar, in de huidige versus tijd trace amperometrische, elk één vesikel rupturing evenement kan resulteren in een huidige voorbijgaande aard en door de integratie van het gebied van elke huidige spike, de vesikel quantal grootte kan worden berekend met behulp van Faraday´s-wet.
Dus door het koppelen van de kwantitatieve informatie opgedaan vesikel grootte metingen met behulp van TEM imaging samen met blaasje quantal grootte analyse, zoals geregistreerd door intracellulaire elektrochemische cytometry, kan blaasje neurotransmitter concentratie ook worden bepaald. Dit maakt de karakterisering van het vesikel wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende osmotische omstandigheden en biedt een betere blik op hoe de blaasjes op extracellulaire osmotische stress in het stadium vóór de exocytose reageert. De resultaten van combinatie van deze methoden hebben aangetoond dat in aanwezigheid van extracellulaire hoge osmotische druk, blaasjes krimpen en hun quantal grootte aanpassen en vergelijken van de kwantitatieve informatie over de relatieve veranderingen van deze metingen dat blijkt tijdens het krimpen wijzigen blaasjes hun inhoud en het formaat te handhaven van een constante neurotransmitter concentratie24. Dus, dit inzicht is waardevol bij het aansluiten van de opmerkingen over neurotransmitter vrijlating in cellen die zijn blootgesteld aan osmotische stress. In deze protocollen beschrijven we het gebruik van deze drie complementaire methoden waarmee de karakterisatie van hoe secretoire blaasjes in hun oorspronkelijke omgeving reageren op extracellulaire osmolaliteit en de gevolgen van deze reactie op de exocytose proces. Naast onze eerdere opmerkingen over het effect van hoge osmotische druk op exocytose24presenteren we extra experimenten die cel herstel na osmotische schok en het effect van meerdere barium stimulaties in chromaffin beschrijven cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Amperometry opname van cellen die zijn onderworpen aan osmotische schok Toon die secretoire cellen op deze fysieke stress reageren doordat de exocytose activiteit en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgelaten uit de blaasjes in één exocytose gebeurtenissen. Er is gesuggereerd dat de vermindering in neurotransmitters verdreven als gevolg van wijzigingen in de membraan biofysische eigenschappen is wanneer cellen in reactie op osmotische stress krimpen en met aannames gemaakt dat secretoire blaasjes in het cytoplasma van de cel ondervinden geen problemen door extracellulaire osmotische stress. Amperometry opname van exocytose controleert wat wordt vrijgelaten uit de cellen het moment een blaasje combineert met het plasma-membraan, maar levert geen informatie over de inhoud van het vesikel voordat de fusie blaasje wordt geactiveerd. Daarom biedt opname met andere aanvullende analytische methoden die kunnen karakteriseren de secretoire blaasjes voordat exocytose op cellen wordt geactiveerd door het combineren van amperometry een breder overzicht voor de behandeling van hoe secretoire blaasjes en de Exocytose proces worden beïnvloed door osmotische schok. We beschrijven hier hoe aanvulling amperometry opnemen met intracellulaire elektrochemische cytometry en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de wijzigingen in de grootte en neurotransmitter inhoud secretoire blaasjes op chromaffin cellen ten opzichte van exocytose activiteit voor en na blootstelling aan osmotische stress. Door de koppeling van de kwantitatieve gegevens die experimenten met behulp van alle drie de analytische methoden, werden conclusies eerder gemaakt dat secretoire blaasjes op extracellulaire osmotische stress reageren door inkrimping in grootte en het blaasje quantal grootte te verminderen het handhaven van een constante vesikel neurotransmitter concentratie. Vandaar, dit geeft duidelijkheid over waarom blaasjes, in reactie op osmotische stress, vermindering van de hoeveelheid neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose release. De amperometrische opnames hier blijkt dit een omkeerbaar proces en dat blaasje nadat osmotische schok worden nagevuld met neurotransmitters wanneer geplaatste cellen zijn teruggekeerd in een isotone milieu.

We beschrijven hier het protocol voor hoe TEM imaging samen met twee elektrochemische methodologieën, koolstofvezel amperometry en intracellulaire elektrochemische cytometry, combineren kunt informeren die krijgt een bredere visie zinspeelt op het effect van extracellulaire osmotische druk op secretoire blaasjes en het proces van exocytose. Door het vergelijken van representatieve amperometrische opnames van exocytose release op één chromaffin cellen met behulp van de experimentele instellen (afgebeeld in <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Lage-stress Route leren met behulp van de Lashley III Maze in Muizen

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Brain Imaging Onderzoek van de Memory-versterkend effect van emotie

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Onderzoek van de aantasting effect van emotie op cognitie

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modellering Neurale Immune Signalering van episodische en chronische migraine gebruik verspreiden Depressie In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Implantatie van osmotische pompen en inductie van stress om een symptomatisch, farmacologisch muismodel voor DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie vast te stellen

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotische pomp-gebaseerde medicijnafgifte voor in vivo remyelinisatieonderzoek op het centrale zenuwstelsel

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...