Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
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Die Autoren möchte der schwedischen Forschungsrat (349-2007-8680) für die Finanzierung und Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Schweden) für die Spende von Rindern Nebennieren zu danken.

(1) Zellkultur Bovine Chromaffin Zellen durch enzymatische Verdauung von Nebennieren isoliert
<ol><li>Um chromaffin Zellen gesammelt aus bovine Nebennieren zu isolieren, Sterilisieren Sie Zellen mit 70 % Ethanol-Lösung. Trim entfernt Fett- und Bindegewebe mit einem Skalpell. Um Blut zu entfernen, spülen Sie die Nebennieren Venen mit Lockes Lösung (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) 5,6 mM bei pH 7,4), die handlich auf 37 ° C.</li>
	<li>Um das Gewebe zu verda...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll und die Vorteile der Kombination von drei ergänzende analytische Methoden zur Analyse von sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess besser zu verstehen wie eine physische Kraft wie osmotischen Druck sekretorischen Vesikel auswirken können und der Exozytose Prozess in sekretorischen Zellen. Diese Methoden umfassen die Kohlefaser-Mikroelektrode strommesstechnik, das ist eine etablierte Methode zur Erfassung von Exozytose Aktivität, intrazelluläre elektrochemische Zytometrie, ...

Chromaffin Zellen in Nebennieren sind neuroendokrine Zellen, die Neurotransmitter-Moleküle in die Blutbahn abgeben. Dies geschieht durch ein zellulärer Prozess, bei dem das Andocken, und die Verschmelzung von Neurotransmitter gefüllten Vesikel, was Inhalt Auflösung von Vesikeln in den extrazellulären Raum in einem Prozess namens Exozytose. Die Neurotransmitter (Adrenalin und Noradrenalin) in chromaffin Zellen werden aktiv von Membranproteinen in großen dichten Kern Vesikel (LDCVs) transportiert und bei hohen Konzentrationen (~0.5-1 M)1,2gespeichert. Ansammlung von Neurotransmittern im Inneren der LDCVs geschieht durch die Affinität von Katecholamin-Moleküle zu den intravesicular Rumpfkern Protein-Matrix bestehend aus Chromogranin Proteine (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, und ein intravesicular cocktail Lösung mit Schlüsselkomponenten für Katecholamin-Verladung und Lagerung in die Blase wie ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in der Lösung und ~ 40 mM verpflichtet, die Protein-Matrix)8Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10und einem pH-Wert von ~5.511,12. Die LDCVs pflegen einen Iso-osmotischen Zustand der Zelle Zytoplasma (310 mOsm/kg)13, obwohl die theoretische gelöste Konzentration in den Vesikeln Summe bis zu mehr als 750 mM. Die Zusammensetzung der einzelnen intravesicular ist nicht nur wichtig für die Verladung und Lagerung Katecholamine, sondern auch für die Aggregation von gelösten Stoffen, dichten Kern-Protein-Matrix. Dies reduziert die Osmolarität der Vesikel wird deutlich reduziert und beeinflussen die Menge Katecholamin, die während der Exozytose5,6freigegeben wird.
Studien über die Wirkung des extrazellulären osmotischen Drucks auf die Exozytose von amperometrischen Aufnahme haben berichtet, dass hoher extrazellulärer osmotischer Druck hemmt Exozytose Aktivität und reduziert die Anzahl der Neurotransmitter abgesondert von einzelnen Vesikel Fächer4,14,15,16,17,18,19. Die Erklärungen dieser Beobachtungen haben auf die mögliche Verbesserung der makromolekularen Engstand in der Zelle Zytoplasma hemmende Vesikel Fusion Events und eine Veränderung in der Membran Biophysikalische Eigenschaften beeinflussen die Anzahl der spekuliert. Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt. Diese Gedanken angenommen hohen extrazellulären osmotischen Stress beeinflusst nicht die Vesikel Quanten Größe, bestimmt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle gespeichert in einem Vesikel-Fach in vorherige Phase der getriggerten Exozytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in konduktometrische Messungen der Exozytose Freisetzung in Einzelzellen, eine Kohlefaser-Scheibe Mikroelektrode steht in engem Kontakt mit der Zelloberfläche, erstellen eine experimentelle Einrichtung imitiert die Synapse-Konfiguration, wo der amperometrischen Elektrode dient als ein postsynaptisches Detektor (Abbildung 1)22,23. Durch die Stimulierung einer Zelle, Exozytose, kann ein Neurotransmitter gefüllten Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran der Zelle und lassen teilweise oder volle Blase Inhalt in den extrazellulären Raum auslösen. Diese Neurotransmitter-Moleküle an der Oberfläche der Elektrode veröffentlicht können elektrochemisch erkannt werden, wenn die Neurotransmitter elektroaktive (z.B. Katecholamine) sind durch die Anwendung ein Redoxpotential von 700 mV Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode . Daher eine Reihe von Stromspitzen markieren die Erkennung der einzelnen Exozytose Ereignisse. Vom aktuellen versus Zeit Spur in einer amperometrischen Aufnahme die Anbaufläche jedes einzelnen amperometrischen Spike stellt die Ladung pro Exozytose Ereignis erkannt und der Maulwurf von Neurotransmittern freigegeben, unter Verwendung der Gleichung Faraday konvertiert werden kann. Daher die konduktometrische Aufnahmen liefern quantitative Informationen über die Menge Neurotransmitter aus einzelnen Exozytose Veranstaltungen vertrieben und Berichten über die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse, sondern präsentieren keine quantitative Informationen über die sekretorischen Vesikel Inhalte vor der Fusion der Vesikel und Neurotransmitter-Freisetzung wurde eingeleitet.
Daher, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel in der Zelle Zytoplasma reagieren auf extrazelluläre osmotischen Stress bevor die Zelle ausgelöst wird, um zu unterziehen, Exozytose, andere ergänzende analytische Methoden verwendet werden können, um diese Informationen zu bereichern. Zum Beispiel um zu untersuchen, ob osmotischen Stress Vesikel Volumen ändert, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bildgebende Analyse lässt sich die Vesikelgröße der Zellen nach chemischen Fixierung zu messen. Um zu untersuchen ob osmotischen Stress Quanten Vesikelgröße betrifft, eine neu entwickelte amperometrischen Technik namens intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgebracht werden, für die Quantifizierung der Vesikel Neurotransmitter Inhalt an sekretorischen Vesikel in ihrer nativen Zustand noch im Zytoplasma der lebenden Zellen26wohnhaft. In der intrazellulären elektrochemische Zytometrie-Technik eine Nanotip zylindrischen Kohlefaser-Elektrode sanft das Zytoplasma von lebenden Zellen und durch die Anwendung einer + 700 mV Potenzial an dieser Elektrode eingefügt (Vs Ag/AgCl Referenz Elektrode), die Katecholamin-Inhalte in Vesikeln quantifiziert werden kann, durch den Nachweis einer Redox Stromspitze aus einzelnen Bläschen kollidieren, adsorbierenden, und anschließend stochastisch Brechung an der Elektrodenoberfläche und damit deren Inhalt gegen die Freigabe der Elektrode Oberfläche26. Daher in der amperometrischen aktuelle versus Zeit Spur, jedes einzelne Vesikel zerreißendes Ereignis kann dazu führen, dass eine aktuelle transiente und, durch die Integration von Bereich des jeweils aktuellen Spike, kann Quanten Vesikelgröße mit Faraday´s Gesetz berechnet werden.
Daher kann durch die Verknüpfung der quantitativen Informationen gewonnenen Vesikel Größenmessungen mit TEM Bildgebung Vesikel Quanten Größe und analysiert, wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgezeichnet, Vesikel Neurotransmitter Konzentration auch werden Sie bestimmt. Dies ermöglicht Vesikel Charakterisierung, wenn Zellen unterschiedliche osmotische Bedingungen ausgesetzt sind und bietet eine bessere Sicht wie Bläschen auf extrazelluläre osmotischen Stress in der Phase vor der Exozytose reagieren können. Die Ergebnisse aus der Kombination dieser Methods haben gezeigt, dass im Beisein von extrazellulären hohen osmotischen Druck, Bläschen schrumpfen und passen Sie ihre Quanten Größe und Vergleich der quantitative Informationen über die relativen Veränderungen dieser Messungen, dass zeigt beim schrumpfen anzupassen Vesikel ihre Inhalt und Größe weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration24. Somit ist dieses Verständnis wertvolle im Anschluss an die Bemerkungen über Neurotransmitter-Freisetzung in Zellen osmotischen Stress ausgesetzt. In diesen Protokollen beschreiben wir die Verwendung dieser drei komplementäre Methoden, mit denen die Charakterisierung der wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung reagieren extrazellulären Osmolalität und die Auswirkungen dieser Reaktion auf die Exozytose Prozesses. Zusätzlich zu unseren bisherigen Beobachtungen über die Wirkung der hohen osmotischen Druck auf Exozytose24präsentieren wir weitere Experimente, die Zelle Erholung nach osmotischen Schock und die Wirkung von mehreren Barium Stimulationen in chromaffin beschreiben Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Strommesstechnik Aufnahme der Zellen ausgesetzt osmotischen Schock zeigen, dass die sekretorische Zellen auf dieser physischen Stress zu reagieren, durch die Reduzierung der Exozytose-Aktivität und die Menge der Neurotransmitter aus Vesikeln im einzigen Exozytose Veranstaltungen veröffentlicht. Es wurde vermutet, dass der Rückgang der Neurotransmitter ausgestoßen aufgrund von Änderungen in Membran Biophysikalische Eigenschaften, ist wenn Zellen als Reaktion auf osmotischen Stress schrumpfen und mit Annahmen, die sekretorischen Vesikel in das Zytoplasma der Zelle sind nicht betroffen durch extrazelluläre osmotischen Stress. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose überwacht, was aus den Zellen im Moment losgelassen wird, den ein Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, den aber enthält keine Angaben über den Inhalt des Vesikels bevor die Fusion der Vesikel ausgelöst wird. Daher, durch die Kombination strommesstechnik Aufnahme mit anderen ergänzenden analytischen Methoden, die sind in der Lage, die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel, bevor Exozytose an Zellen ausgelöst wird bietet einen umfassenderen Überblick für die Prüfung wie sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess werden durch osmotischen Schock betroffen. Wir beschreiben hier, wie ergänzend strommesstechnik Aufnahme mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie und Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung kann verwendet werden, um Änderungen im sekretorischen Vesikel Größe und Neurotransmitter an charakterisieren chromaffin Zellen im Zusammenhang mit Exozytose Tätigkeit vor und nach der Exposition auf osmotischen Stress. Durch die Verknüpfung der quantitative Erkenntnisse aus Experimenten mit allen drei analytische Methoden, wurden Schlussfolgerungen zuvor gemacht, dass sekretorischen Vesikel auf extrazelluläre osmotischen Stress reagieren, indem in der Größe schrumpfen und die Vesikel Quanten Größe zu reduzieren behalten Sie eine konstante Vesikel Neurotransmitter Konzentration. Daher gibt das einige Klarstellungen hinsichtlich warum Vesikel, in Reaktion auf osmotischen Stress die Menge Neurotransmitter bei Freigabe Exozytose freigesetzt reduzieren. Die konduktometrische Aufnahmen hier zeigen, dass dies ist ein reversibler Prozess und das telson, nachdem osmotischen Schock mit Neurotransmittern aufgefüllt werden, wenn die gesetzten Zellen in einer isotonischen Umgebung rückgängig gemacht werden.

Wir beschreiben hier das Protokoll, für wie kombinieren TEM Bildgebung zusammen mit zwei elektrochemische Methoden, Kohlefaser-strommesstechnik und intrazellulären elektrochemische Zytometrie, Auskunft geben kann, die eine breitere Sicht in Anspielung auf die Wirkung der gewinnt extrazelluläre osmotischen Druck auf die sekretorischen Vesikel und Exozytose Prozess. Vergleicht man repräsentative amperometrischen Aufnahmen der Exozytose Release auf einzelne chromaffin Zellen mit der experimentellen eingerichtet (in <str...

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Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Low-Stress-Route Learning Mit dem Lashley III Maze in Mäuse

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Brain Imaging Untersuchung der Memory-Effekt der Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Untersuchung der beeinträchtigende Wirkung von Emotion auf Kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signalisierung von episodischen und chronischen Migräne mit Spreading Depression In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...