Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare il Consiglio svedese della ricerca (349-2007-8680) per il finanziamento e Dalsjöfors Kött AB (Karlstad, Svezia) per la donazione di ghiandole surrenali bovini.

1. cella cultura delle cellule cromaffini Bovine isolate tramite digestione enzimatica dalle ghiandole surrenali
<ol><li>Per isolare le cellule cromaffini raccolte dalle ghiandole surrenali bovini, sterilizzare le cellule con una soluzione di etanolo 70%. Tagliare via grasso e tessuto connettivo usando un bisturi. Per rimuovere sangue, sciacquare le vene surrenali utilizzando soluzione di Locke (154mm NaCl, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) 5,6 mM a pH 7.4) che è stato termo...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Qui presentiamo un protocollo e i vantaggi della combinazione di tre metodi analitici complementari per analizzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi di acquisire una migliore comprensione di come una forza fisica come la pressione osmotica può influenzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi in cellule secretive. Questi metodi includono amperometria microelettrodo di fibra di carbonio, che è un metodo consolidato per la registrazione di attività di esocitosi, intracellulare cytometry ele...

Le cellule cromaffini in ghiandole surrenali sono cellule neuroendocrine che rilasciano molecole di neurotrasmettitore nel flusso sanguigno. Questo avviene attraverso un processo cellulare che coinvolge l'attracco e la fusione delle vescicole piene di neurotrasmettitori, conseguente rilascio contenuto dalle vescicole allo spazio extracellulare in un processo chiamato esocitosi. I neurotrasmettitori (adrenalina e noradrenalina) nelle cellule cromaffini sono attivamente trasportati da proteine di membrana in vescicole grande nucleo denso (LDCVs) e conservati a alte concentrazioni (~0.5-1 M)1,2. Accumulazione dei neurotrasmettitori all'interno del LDCVs, impostando l'affinità delle molecole della catecolammina alla matrice della proteina di intravesicular nucleo denso composta chromogranin proteine (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6e una soluzione cocktail intravesicular contenente componenti chiave per il caricamento della catecolamina e deposito nella vescicola come ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM nella soluzione e ~ 40 mM associato ai matrice proteica)8,9Mg2 + (5 mM), ascorbato (10-30 mM)10e un pH di ~5.511,12. Il LDCVs mantenere una condizione di iso-osmotico con il citoplasma delle cellule (310 mOsm/kg)13, anche se la concentrazione del soluto teorica all'interno delle vescicole sommare fino a più di 750 mM. La composizione dei componenti intravesicular non è solo essenziale per il caricamento e l'archiviazione delle catecolamine, ma anche per l'aggregazione di soluti di matrice della proteina di nucleo denso. Questo riduce significativamente l'osmolarità delle vescicole è significativamente ridotta e può influenzare la catecolammina importo che viene rilasciata durante l'esocitosi5,6.
Studi sull'effetto della pressione osmotica extracellulare sul processo di esocitosi di registrazione amperometrici sono segnalati che alta pressione osmotica extracellulare inibisce l'attività di esocitosi e riduce il numero di neurotrasmettitori secernuta dal singolo vescicola scomparti4,14,15,16,17,18,19. Le spiegazioni di queste osservazioni hanno speculato sulla valorizzazione possibile di affollamento macromolecolare negli eventi di fusione cellulare citoplasma d'inibizione della vescicola e un'alterazione nella proprietà biofisiche della membrana che interessano il numero di neurotrasmettitori rilasciati durante l'esocitosi. Questi pensieri presume che stress osmotico extracellulare elevato non pregiudica la dimensione quantal della vescicola, che definisce il numero di molecole di neurotrasmettitore memorizzati in un vano della vescicola in fase preventiva di esocitosi innescata14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperometrico di misura del rilascio di esocitosi in singole cellule un microelettrodo di disco di fibra di carbonio è posto a stretto contatto con la superficie delle cellule, creando un'impostazione sperimentale che imita la configurazione di sinapsi, dove l'amperometrico elettrodo funge da un rivelatore postsinaptici (Figura 1)22,23. Stimolando una cella per esocitosi, uno può indurre vescicole piene di neurotrasmettitori per fondersi con la membrana plasmatica delle cellule e rilasciare il contenuto completo della vescicola o parte nello spazio extracellulare. Queste molecole di neurotrasmettitore rilasciate sulla superficie dell'elettrodo possono essere rilevate elettrochimicamente se i neurotrasmettitori sono elettroattivi (ad es., catecolamine) applicando un potenziale redox di + 700 mV vs un elettrodo di riferimento Ag/AgCl . Di conseguenza, una serie di picchi di corrente contrassegnare il rilevamento di eventi singoli esocitosi. Dalla corrente rispetto al tracciato temporale in una registrazione amperometrico, l'area sotto ogni singolo amperometrico spike rappresenta il costo rilevato per ogni evento di esocitosi e può essere convertito alla mole di neurotrasmettitori rilasciati, usando l'equazione di Faraday. Quindi, le registrazioni di amperometrico forniscono informazioni quantitative sui neurotrasmettitori quantità espulsi da eventi di singolo esocitosi e registrare la frequenza degli eventi di esocitosi, ma non presentano informazioni quantitative sulle vescicole secretorie contenuto prima della fusione della vescicola e del rilascio di neurotrasmettitore è stata avviata.
Pertanto, per ottenere una migliore comprensione delle vescicole secretorie come nella cella citoplasma rispondere agli stress osmotico extracellulare prima che la cella venga attivata per subire l'esocitosi, altri metodi analitici complementari possono essere utilizzati per arricchire queste informazioni. Per esempio, per studiare se lo stress osmotico altera il volume delle vescicole, microscopia elettronica a trasmissione (TEM) analisi di imaging può essere utilizzata per misurare le dimensioni delle vescicole delle cellule dopo la fissazione chimica. Per esaminare se lo stress osmotico influisce sulle dimensioni quantal della vescicola, una tecnica sviluppata di recente amperometrico chiamata intracellulare cytometry elettrochimica, può essere applicato per la quantificazione del contenuto di neurotrasmettitore vescicola alle vescicole secretorie in loro stato nativo quando ancora residente nel citoplasma delle cellule vive26. Nella tecnica elettrochimica intracellulare cytometry, un elettrodo cilindrico in fibra di carbonio nanotip viene delicatamente inserito nel citoplasma di cellule vive e, applicando un potenziale di + 700 mV a questo elettrodo (elettrodo di riferimento vs un Ag/AgCl), il contenuto della catecolamina in vescicole può essere quantificata tramite la rilevazione di un picco di corrente di redox da vescicole singole collisione, adsorbente e successivamente casualmente rottura alla superficie dell'elettrodo e quindi rilasciando il loro contenuto contro il elettrodo superficiale26. Quindi, nell'amperometrica corrente rispetto al tracciato temporale, ogni evento di rottura della vescicola singolo può provocare un transitorio di corrente e, integrando l'area di ogni picco di corrente, la dimensione quantal vescicola può essere calcolata usando la legge di Faraday´s.
Pertanto, collegando le informazioni quantitative acquisite misure di dimensione delle vescicole usando la formazione immagine TEM insieme con analisi della vescicola quantal dimensione, così come registrato da intracellulare cytometry elettrochimica, concentrazione del neurotrasmettitore della vescicola può anche essere determinato. Questo permette la caratterizzazione della vescicola quando le cellule sono esposte a differenti condizioni osmotiche e fornisce una vista migliore su come vescicole possono rispondere agli stress osmotico extracellulare nella fase prima dell'esocitosi. I risultati dalla combinazione di questi metodi hanno dimostrato che in presenza, ad alta pressione osmotica extracellulare vescicole strizzacervelli e regolare la loro dimensione quantali e confrontando le informazioni quantitative sui cambiamenti relativi da queste misurazioni dimostra che durante la contrazione, vescicole regolare loro contenuto e le dimensioni per mantenere una concentrazione di neurotrasmettitore costante24. Così, questa comprensione è utile in collegamento per le osservazioni fatte sul rilascio di neurotrasmettitori in cellule esposte a stress osmotico. In questi protocolli, descriviamo l'uso di queste tre metodologie complementari che consentono la caratterizzazione delle vescicole secretorie come nel loro ambiente nativo rispondere alla osmolarità extracellulare e gli effetti di questa risposta su esocitosi processo. Oltre alle nostre osservazioni precedenti per quanto riguarda l'effetto dell'alta pressione osmotica su esocitosi24, presentiamo gli esperimenti supplementari che descrivono il recupero delle cellule dopo shock osmotico e l'effetto di molteplici stimolazioni di bario in cromaffini cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Amperometria registrazione delle cellule sottoposti a shock osmotico dimostrano che cellule secretive rispondono a questo sforzo fisico riducendo l'attività di esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato da vescicole in eventi di singolo esocitosi. È stato suggerito che la riduzione in neurotrasmettitori espulso è dovuto le alterazioni nella proprietà biofisiche della membrana quando cellule restringono in risposta allo stress osmotico e con presupposti che non sono interessate vescicole secretorie nel citoplasma delle cellule da extracellulare stress osmotico. Amperometria registrazione di esocitosi monitora ciò che viene rilasciato dalle cellule al momento una vescicola si fonde con la membrana plasmatica, ma non fornisce informazioni sul contenuto della vescicola prima che la fusione della vescicola è attivata. Pertanto, combinando amperometria registrazione con altri metodi analitici complementari che sono in grado di caratterizzare le vescicole secretorie prima che venga attivato l'esocitosi alle cellule offre una panoramica più ampia per l'esame come secretive vescicole e la processo di esocitosi sono interessati da shock osmotico. Qui descriviamo come complemento amperometria registrazione con intracellulare cytometry elettrochimica e formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione può essere utilizzato per caratterizzare le alterazioni nei contenuti di dimensione e neurotrasmettitore di vescicole secretorie in cellule cromaffini in relazione all'attività di esocitosi prima e dopo l'esposizione a stress osmotico. Collegando le informazioni quantitative acquisite dagli esperimenti utilizzando tutti i tre metodi di analisi, conclusioni sono state fatte in precedenza che vescicole secretorie rispondano agli stress osmotico extracellulare shrinking nel formato e riducendo la dimensione quantal vescicola a mantenere una concentrazione di neurotrasmettitore costante della vescicola. Quindi, questo dà alcuni chiarimenti per quanto riguarda perché le vescicole, in risposta a stress osmotico, riducono i neurotrasmettitori di importo rilasciati durante il rilascio di esocitosi. Le registrazioni di amperometrico qui indicano che questo è un processo reversibile e quella della vescicola dopo shock osmotico sono riforniti con neurotrasmettitori quando posizionate cellule vengono ripristinate in un ambiente isotonico.

Descriviamo qui il protocollo per come formazione immagine TEM insieme due metodologie elettrochimiche, fibra di carbonio amperometria e intracellulare cytometry elettrochimica, la combinazione può fornire informazioni che guadagna una visione più ampia, alludendo all'effetto di pressione osmotica extracellulare su vescicole secretorie e il processo di esocitosi. Confrontando il rappresentante amperometrico registrazioni di esocitosi rilascio alle singole cellule cromaffini utilizzando lo sperimentale istituito (mostra...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Lo stress osmotico colpisce esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante questo processo. Dimostriamo come combinando metodi elettrochimici insieme con microscopia elettronica di trasmissione può essere utilizzato per studiare l'effetto della pressione osmotica extracellulare per attività di esocitosi, vescicola quantal dimensione e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante esocitosi.

L'effetto di Stress osmotico su vescicole secretorie ed esocitosi di monitoraggio

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Low-stress Learning percorso con la Maze Lashley III nel Mice

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Ricerca

Neuroscienze

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Indagine Imaging cerebrale della memoria effetto di intensificazione delle emozioni

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Imaging cerebrale Indagine di compromettere l&#39;effetto delle emozioni sulla cognizione

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modellistica neurale segnalazione immunitario di emicrania episodica e cronica utilizzo Depressione Diffusione In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Impianto di pompe osmotiche e induzione dello stress per stabilire un modello sintomatico, farmacologico del mouse per DYstonia DYT/PARK-ATP1A3

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Somministrazione di farmaci a base di pompa osmotica per la ricerca sulla rimielinizzazione in vivo sul sistema nervoso centrale

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...