Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
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Os autores gostaria de agradecer o Conselho Sueco de pesquisa (349-2007-8680) para financiamento e Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Suécia) pela doação de bovinos das glândulas supra-renais.

1. celular cultura de bovinas células cromafins isoladas por digestão enzimática de glândulas supra-renais
<ol><li>Para isolar células cromafins coletadas de bovinos das glândulas supra-renais, esterilize células com solução de etanol 70%. Apare fora gordura e tecido conjuntivo usando um bisturi. Para remover o sangue, lave as veias adrenais usando solução de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hidroxietil piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) 5,6 mM, pH 7,4) que tem sido termostatizada a 37 ° ...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Aqui apresentamos um protocolo e as vantagens da combinação de três métodos analíticos complementares para análise de vesículas secretoras e o processo de exocitose para ganhar uma melhor compreensão de como uma força física, tais como a pressão osmótica pode afetar vesículas secretoras e o processo de exocitose em células secretoras. Estes métodos incluem amperometry de microeletrodos de fibra de carbono, que é um método estabelecido para gravar a atividade de exocitose, citometria eletroquímica intrac...

Células cromafins em glândulas supra-renais são células neuroendócrinas que liberam moléculas de neurotransmissor na corrente sanguínea. Isto ocorre através de um processo celular que envolve o encaixe e a fusão de vesículas cheias de neurotransmissores, resultando em liberação de conteúdo de vesículas para o espaço extracelular em um processo chamado exocitose. Os neurotransmissores (adrenalina e noradrenalina) nas células cromafins são ativamente transportados por proteínas de membrana em vesículas grande núcleo denso (LDCVs) e armazenados em altas concentrações (~0.5-1 M)1,2. Acúmulo de neurotransmissores dentro as LDCVs é conseguido a afinidade das moléculas de catecolaminas para a matriz de proteína intravesicular denso núcleo composta de cromogranina proteínas (~ 169 mg/mL),3,4,5 ,6e uma solução de cocktail intravesicular contendo componentes-chave para armazenamento e carregamento de catecolaminas da vesícula como o ATP (125-300mm)7, Ca2 + (50-100 µM na solução e ~ 40 mM ligado para o matriz de proteína)8, Mg2 + (5 mM)9, ascorbato (10-30 mM)10e um pH de11,de ~5.512. Os LDCVs mantenham uma condição de iso-osmótica com a célula citoplasma (310 mOsm/kg)13, mesmo que a concentração de soluto teórica dentro as vesículas soma até mais de 750 mM. A composição dos componentes intravesicular não só é essencial para o carregamento e armazenamento de catecolaminas, mas também para a agregação de solutos para a matriz de proteína de núcleo denso. Isto reduz significativamente a osmolaridade das vesículas é significativamente reduzida e pode afetar a catecolamina quantidade que é liberada durante a exocitose5,6.
Estudos sobre o efeito da pressão osmótica extracelular sobre o processo de exocitose por gravação amperométrico relataram essa alta pressão osmótica extracelular inibe a atividade de exocitose e reduz o número de neurotransmissores secretados de único vesículas compartimentos4,14,15,16,17,18,19. As explicações destas observações têm especulado sobre o possível reforço do apinhamento macromolecular em eventos de fusão de vesículas inibindo o célula citoplasma e uma alteração nas propriedades biofísicas de membrana que afetam o número de neurotransmissores liberados durante a exocitose. Estes pensamentos assumiram que alto estresse osmótico extracelular não afeta o tamanho de vesículas quantal, que define o número de moléculas de neurotransmissor armazenado em um compartimento de vesículas na fase prévia de exocitose desencadeada14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. em amperométrico medições de exocitose liberação de células únicas, um microeléctrodo de disco de fibra de carbono é colocado em contato com a superfície da célula, criando um conjunto experimental até imitando a configuração de sinapse, onde o amperométrico eletrodo serve como um detector pós-sináptico (Figura 1)22,23. Estimulando uma célula a exocitose, pode-se induzir vesículas cheias de neurotransmissores se fundem com a membrana plasmática de célula e liberar a parte ou o conteúdo completo da vesícula para o espaço extracelular. Estas moléculas de neurotransmissor liberadas na superfície do eléctrodo podem ser detectadas eletroquimicamente se os neurotransmissores são eletroativos (por exemplo, catecolaminas) aplicando um potencial redox de 700 mV vs um eletrodo de referência Ag/AgCl . Por conseguinte, uma série de picos de corrente marca a detecção de eventos individuais exocitose. A corrente contra rastreamento de tempo em uma gravação de amperométrico, a área sob cada espiga amperométrico único representa a carga detectada por evento de exocitose e pode ser convertida para a toupeira de neurotransmissores liberados, usando a equação de Faraday. Portanto, as gravações amperométrico fornecem informações quantitativas sobre os neurotransmissores quantidade expelidos de eventos único exocitose e relatam sobre a frequência de eventos de exocitose, mas não apresentam informações quantitativas sobre as vesículas secretoras iniciou-se o conteúdo antes da fusão de vesículas e liberação de neurotransmissores.
Portanto, para obter uma melhor compreensão de como secretoras vesículas na célula citoplasma responder ao estresse osmótico extracelular antes que a célula é acionada para se submeter a exocitose, outros métodos analíticos complementares podem ser usados para enriquecer esta informação. Por exemplo, para investigar se estresse osmótico altera o volume de vesículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) análise de imagem pode ser usada para medir o tamanho de vesículas de células após a fixação química. Para examinar se estresse osmótico afeta tamanho quantal vesículas, uma técnica recentemente desenvolvidos amperométrico chamada citometria eletroquímica intracelular, pode ser aplicado para a quantificação do conteúdo de neurotransmissor de vesículas em vesículas secretoras no seu estado nativo quando ainda residindo no citoplasma das células vivas,26. Na técnica de citometria de eletroquímica intracelular, um eletrodo cilíndrico de fibra de carbono de nanotip é delicadamente inserido no citoplasma das células vivas e, aplicando um potencial de mV 700 para o eletrodo (eletrodo de referência vs um Ag/AgCl), o conteúdo de catecolaminas nas vesículas pode ser quantificado pela detecção de um pico de corrente redox de vesículas único colidindo, fixando e posteriormente estocàstica ruptura na superfície do eletrodo e, assim, liberando seu conteúdo contra o eletrodo superfície26. Portanto, no amperométrico atual contra rastreamento de tempo, cada evento rompendo vesícula única pode resultar em uma corrente transitória e, integrando a área de cada pico atual, o tamanho quantal vesículas pode ser calculado usando a lei de Faraday´s.
Portanto, vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com medições de tamanho de vesículas utilizando TEM imagens juntamente com a análise de tamanho de quantal de vesículas, como registrado por citometria de eletroquímica intracelular, concentração do neurotransmissor de vesículas pode também ser determinada. Isto permite a caracterização de vesículas quando as células estão expostas a diferentes condições osmóticos e fornece uma visão melhor sobre como vesículas podem responder ao estresse osmótico extracelular na fase antes da exocitose. Os resultados da combinação desses métodos demonstraram que na presença de extracelular alta pressão osmótica, vesículas encolhem e ajustar seu tamanho quantal e mostra que, comparar as informações quantitativas sobre alterações relativas a partir dessas medições enquanto a encolher, vesículas ajuste seus conteúdos e tamanho para manter um neurotransmissor constante concentração24. Assim, este entendimento é valioso em conexão com as observações feitas na liberação do neurotransmissor em células expostas ao estresse osmótico. Estes protocolos, descrevemos o uso dessas três metodologias complementares que permitem a caracterização das vesículas secretoras como em seu ambiente nativo responder a osmolalidade extracelular e os efeitos da resposta sobre a exocitose processo. Além de nossas observações anteriores sobre o efeito da alta pressão osmótica na exocitose24, apresentamos experimentos adicionais que descrevem a recuperação celular após choque osmótica e o efeito de vários estímulos de bário em cromafim células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Amperometry gravação de células submetidas a choque osmotic mostrar que as células secretoras respondem a este estresse físico, reduzindo a atividade de exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado de vesículas em eventos de exocitose único. Sugeriu que a redução de neurotransmissores expulso é devido a alterações nas propriedades biofísicas de membrana quando células encolhem em resposta a estresse osmótico e com as suposições feitas que secretoras vesículas no citoplasma celular não são afetadas pela pressão osmótica extracelular. Amperometry gravação de exocitose monitora o que é liberado das células no momento uma vesícula funde-se com a membrana plasmática, mas não fornece informações sobre o conteúdo da vesícula antes da fusão de vesículas é disparada. Portanto, combinando amperometry gravação com outros métodos analíticos complementares capazes de caracterizar as vesículas secretoras antes de exocitose em células é disparada oferece uma visão mais ampla para analisar como secretoras vesículas e o processo de exocitose são afetados pelo choque osmótica. Aqui descrevemos como complementar amperometry gravando com citometria eletroquímica intracelular e imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão pode ser usado para caracterizar alterações no conteúdo de tamanho e neurotransmissor de vesículas secretoras no células cromafins em relação à atividade de exocitose antes e após a exposição ao estresse osmótico. Vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com experimentos usando todos os três métodos analíticos, conclusões foram feitas anteriormente que vesículas secretoras responderem a pressão osmótica extracelular a encolher no tamanho e reduzindo o tamanho da vesícula quantal a manter uma concentração de neurotransmissor de vesículas constante. Portanto, isto dá algum esclarecimento sobre por vesículas, em resposta a estresse osmótico, reduzem os neurotransmissores montante lançados durante lançamento de exocitose. As gravações de amperométrico aqui indicam que este é um processo reversível e essa vesícula após choque osmotic são recarregados com neurotransmissores quando colocadas células são revertidas em um ambiente de isotônico.

Aqui descrevemos o protocolo para como combinar imagens TEM juntamente com duas metodologias eletroquímicas, fibra de carbono amperometry e intracelular citometria de eletroquímica, pode fornecer informações que ganha uma visão mais ampla, aludindo ao efeito de pressão osmótica extracelular em vesículas secretoras e o processo de exocitose. Comparando o representante amperométrico gravações de liberação de exocitose no única células cromafins usando o experimental Setup (mostrado na Fi...

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Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Baixa tensão de Aprendizagem Route Usando o Lashley Maze III em Ratos

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Neurociência

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Investigação de imagens do cérebro do Efeito Memória de aumento da Emoção

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Investigação por imagem do cérebro o efeito prejudicial da emoção sobre a Cognição

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Implantação de Bombas Osmóticas e Indução de Estresse para Estabelecer um Modelo de Rato Sintomático e Farmacológico para DyT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...