Name: monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Författarna vill tacka Vetenskapsrådet (349-2007-8680) för finansiering och Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) för donation av nötkreatur binjurarna.

1. cellkultur för nötkreatur Chromaffin celler som isolerats genom enzymatisk nedbrytning från binjurarna
<ol><li>För att isolera chromaffin celler som samlats in från nötkreatur binjurarna, sterilisera du celler med 70% etanol lösningen. Putsa bort fett och bindväv med en skalpell. Ta bort blod, skölj adrenal venerna med Lockes lösning (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxietylstärkelse piperazineethanesulfonic syra (HEPES) 5,6 mM vid pH 7,4) som har varit Termostatstyrt till 37 ° C.</li>
	<li>At...

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

Här presenterar vi ett protokoll och fördelarna med att kombinera tre kompletterande analytiska metoder för att analysera sekretoriska vesikler och exocytos processen att få en bättre förståelse för hur en fysisk kraft såsom osmotiska trycket kan påverka sekretoriska vesikler och processen exocytos i sekretoriska celler. Dessa metoder inkluderar kolfiber mikroelektrod amperometry, som är en etablerad metod för inspelning exocytos aktivitet, intracellulära elektrokemiska flödescytometri, som används för at...

Chromaffin celler i binjurarna är neuroendokrina celler som frigör signalsubstansen molekyler i blodet. Detta sker genom en cellulär process som involverar dockning och fusion av signalsubstansen-fyllda blåsor, vilket resulterar i innehåll frigörare från blåsor till det extracellulära utrymmet i en process som kallas exocytos. Signalsubstanserna (adrenalin och noradrenalin) i chromaffin celler är aktivt transporteras av membranproteiner in stora tät kärna blåsor (LDCVs) och lagras vid höga koncentrationer (~0.5-1 M)1,2. Ackumulering av neurotransmittorer inuti LDCVs åstadkoms av katekolamin molekyler affinitet till intravesicular tät kärna protein matrix består av chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, och en intravesicular cocktail lösning som innehåller viktiga komponenter för katekolamin lastning och lagring i vesikler som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i lösning och ~ 40 mM bunden till den protein matrix)8Mg2 + (5 mM)9, askorbat (10-30 mM)10och ett pH på ~5.511,12. LDCVs bibehålla en isoosmotisk tillstånd med cell cytoplasman (310 mOsm/kg)13, även om den teoretiska lösningens koncentrationen inuti blåsor summera upp till mer än 750 mM. Sammansättningen av intravesicular komponenter är inte bara viktigt för lastning och lagring av katekolaminer, men också för aggregering av koncentrationsfördelningen till tät kärna protein matrix. Vilket avsevärt minskar blåsor osmolaritet minskas avsevärt och kan påverka de belopp katekolamin som frigörs under exocytos5,6.
Studier på effekten av extracellulära osmotiska trycket på processen exocytos av amperometrisk inspelning har rapporterat att höga extracellulära osmotiska trycket hämmar exocytos aktivitet och minskar antalet neurotransmittorer som utsöndras från singel vesikler fack4,14,15,16,17,18,19. Förklaringar av dessa observationer har spekulerat om möjligt förbättrande av makromolekylära trängs i cell cytoplasman hämmande vesikler fusion händelserna, och en förändring i membran biofysiska egenskaper som påverkar antalet neurotransmittorer frigörs vid exocytos. Dessa tankar antas att höga extracellulära osmotisk stress inte påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, som definierar antalet signalsubstansen molekyler lagras i vesikler kupé i tidigare skede av utlösta exocytos14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. i amperometrisk mätningar av exocytos release i enstaka celler, en kolfiber skiva mikroelektrod placeras i nära kontakt med cellytan, skapa en experimentell uppsättning upp härma synaps konfiguration, där amperometrisk elektroden fungerar som en postsynaptiska detektor (figur 1)22,23. Genom att stimulera en cell till exocytos, förmå en neurotransmittor-fyllda blåsor till säkring med plasma cellmembranet och släppa en del eller hela vesikler innehållet i det extracellulära utrymmet. Dessa signalsubstansen molekyler släppt på ytan av elektroden kan upptäckas elektrokemiskt om signalsubstanser är elektroaktiva (t.ex., katekolaminer) genom att tillämpa en redoxpotential av +700 mV vs en referenselektrod av Ag/Granulatfyllda . Följaktligen, markera en rad aktuella spikar detektion av enskilda exocytos händelser. Från nuvarande kontra tid spår i en amperometrisk inspelning, området under varje enskild amperometrisk spike representerar den avgift som upptäckts per exocytos händelse och kan omvandlas till Mullvaden av signalsubstanser som släppt, med hjälp av Faraday ekvation. Därför amperometrisk inspelningarna ger kvantitativ information om mängden signalsubstanser utvisas från enda exocytos händelser och rapportera om frekvensen av exocytos händelser, men innebär inte kvantitativa uppgifter om de sekretoriska vesikler innehåll tidigare vesikler fusion och neurotransmitterfrigöraren har inletts.
Därför, för att få en bättre förståelse för hur sekretoriska vesikler i cellen cytoplasman svara på extracellulära osmotisk stress innan cellen utlöses för att genomgå exocytos, andra kompletterande analytiska metoder kan användas för att berika denna information. Exempelvis för att undersöka om osmotisk stress förändrar vesikler volym, kan transmissionselektronmikroskopi (TEM) imaging analys användas att mäta vesikler storleken på celler efter kemiska fixering. För att undersöka om osmotisk stress påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, en nyligen utvecklad amperometrisk teknik som kallas intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan tillämpas för kvantifiering av vesikler signalsubstansen innehåll på sekretoriska vesikler i deras infödda tillstånd när fortfarande är bosatta i cytoplasman i levande celler26. I den intracellulära elektrokemiska flödescytometri tekniken, en nanotip cylindriska kolfiber elektrod infogas försiktigt i cytoplasman av levande celler och, genom att tillämpa en +700 mV-potential till denna elektrod (vs en Ag/Granulatfyllda referens elektrod), den katekolamin innehåll i blåsor kan kvantifieras genom påvisande av en redox nuvarande spike från enstaka blåsor kollidera, absorberande, och därefter stochastically spricker vid elektrod ytan och därmed släppa deras innehåll mot den elektrod ytan26. Därav, i amperometrisk nuvarande kontra tid spårning, varje enstaka vesikel spricker händelse kan resultera i en nuvarande övergående och genom att integrera området i varje nuvarande spike, vesikler kvantfysikaliska storlek kan beräknas med Faraday´s lag.
Därför, genom att länka den kvantitativa informationen från vesikler storlek mätningar med TEM imaging tillsammans med vesikler kvantfysikaliska storlek analys, som registrerats av intracellulära elektrokemiska flödescytometri, vesikler neurotransmittorn koncentration kan också bestämmas. Detta tillåter vesikler karakterisering när celler utsätts för olika osmotiska förhållanden och ger en bättre överblick på hur blåsor kan svarar på extracellulära osmotisk stress i skedet före exocytos. Resultaten från att kombinera dessa metoder har visat att närvaro av extracellulära höga osmotiska trycket, blåsor krympa och justera deras kvantfysikaliska storlek och jämföra den kvantitativa uppgifter om de relativa förändringarna av dessa mätningar visar att samtidigt krymper justera blåsor deras innehåll och storlek att upprätthålla en konstant neurotransmittorn koncentration24. Denna förståelse är alltså värdefullt i anslutning till de iakttagelser som gjorts på neurotransmitterfrigöraren i celler utsätts för osmotisk stress. I protokollen beskriver vi användning av dessa tre kompletterande metoder som tillåter karakterisering av hur sekretoriska vesikler i deras infödda miljö besvara extracellulär osmolalitet och effekterna av detta svar på exocytos processen. Förutom våra tidigare iakttagelser angående effekten av höga osmotiska trycket på exocytos24presenterar vi ytterligare experiment som beskriver cellen återhämtning efter osmotiska chock och effekten av flera barium stimuli i chromaffin celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M-2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:129px;">Roche, Sweden</td>
			<td style="width:119px;">11 213 857 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">100-&#181;M Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Fisher Sientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Percoll</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">354416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Avanti J-20XP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:129px;">Sutter instrument Co., Novato, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc., Japan</td>
			<td style="width:119px;">PE-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Epoxy solutions (A and B)</td>
			<td style="width:129px;">Epoxy technology, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Beveller</td>
			<td style="width:129px;">Narishing Inc.</td>
			<td style="width:119px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Patch clamp Instrument</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:119px;">Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Burleigh Instrument Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">PCS-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Butane Flame</td>
			<td style="width:129px;">Multiflame AB, H&#228;sselholm, Sweden</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:129px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">Leo 912 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

Amperometry inspelning av celler utsätts för osmotiska chock visar att sekretoriska celler svarar på denna fysiska stress genom att minska aktiviteten exocytos och mängden signalsubstans som släppt från blåsor i enda exocytos händelser. Det har föreslagits att minskningen av signalsubstanser utvisas beror på förändringar i membran biofysiska egenskaper när celler krympa svar på osmotisk stress och med antaganden som sekretoriska vesikler i cellens cytoplasma påverkas inte av extracellulära osmotisk stress. Amperometry inspelning av exocytos övervakar vad frisätts från cellerna nu en vesikel säkringar med plasmamembranet, men ger inte information om vesikler innehållet innan vesikler fusion utlöses. Därför, genom att kombinera amperometry inspelning med andra kompletterande analytiska metoder som kan karaktärisera de sekretoriska vesikler innan exocytos vid celler utlöses erbjuder en bredare överblick för att pröva hur sekretoriska vesikler och exocytos processen påverkas av osmotiska chock. Här beskriver vi hur kompletterar amperometry inspelning med intracellulära elektrokemiska flödescytometri och överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging kan användas för att karaktärisera förändringar i sekretoriska vesikler storlek och signalsubstansen innehåll på chromaffin celler i förhållande till exocytos verksamhet före och efter exponering för osmotisk stress. Genom att länka den kvantitativa informationen från experiment med alla tre analytiska metoder, gjorts slutsatser tidigare att sekretoriska vesikler svarar på extracellulära osmotisk stress genom minskat i storlek och minska vesikler kvantfysikaliska storlek till upprätthålla en konstant vesikler neurotransmittorn koncentration. Detta ger därför ett förtydligande angående varför blåsor, som svar på osmotisk stress, minska mängden neurotransmittorer frigörs vid exocytos release. Amperometrisk inspelningarna här tyder detta en reversibel process och att vesikler efter osmotiska chock är återfyllas med signalsubstanser när placerade celler återställs till en isoton miljö.

Vi beskriver här protokollet för hur kombinera TEM imaging tillsammans med två elektrokemiska metoder, kolfiber amperometry och intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan ge information som når en bredare syn som anspelar på effekten av extracellulära osmotiska trycket på sekretoriska vesikler och processen exocytos. Genom att jämföra representativa amperometrisk inspelningar av exocytos release på enstaka chromaffin celler använder den experimentella ställa in (visas i figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Osmotisk stress påverkar exocytos och mängden signalsubstans släppt under denna process. Vi visar hur kombinera elektrokemiska metoder tillsammans med transmissionselektronmikroskopi kan användas för att studera effekten av extracellulära osmotiska trycket på exocytos aktivitet, vesikler kvantfysikaliska storlek och mängden signalsubstans släppt under exocytos.

Övervaka effekten av osmotisk Stress på sekretoriska vesikler och exocytos

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Låg-stress Route lärande Använda Lashley III Maze hos möss

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Brain Imaging Utredning av Memory-ökad påverkan av Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Undersökning av försämra Effekt av Emotion på kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modellering Neurala Immun Signalering av episodiska och kronisk migrän Använda Spridning Depression In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion av oligomera amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Karakterisering av immuncell-härledda extracellulära blåsor och studera funktionell påverkan på cellmiljön

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Implantation av osmotiska pumpar och induktion av stress för att etablera en symptomatisk, farmakologisk mus modell för DYT/PARK-ATP1A3 Dystoni

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Osmotisk pumpbaserad läkemedelsleverans för In Vivo remyelinationsforskning om centrala nervsystemet

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...