Name: visualization of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures at JoVE.com

ونشكر أيضا اليد غابرييل لقراءة نقدية.

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجان رعاية الحيوان من جامعة أوساكا وجمعية علم الأعصاب اليابان.
1-أورجانوتيبيك كوكولتوريس من قشرة الدماغ والمهاد
ملاحظة: للإجراءات المفصلة، الرجوع إلى الأصل المنشورات7،،من<sup...

<ol>
	<li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat:+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis.">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li><li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+development:+how+are+we+going+to+get+there.">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li><li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex.">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li><li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li><li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dynamics.">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations.">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li><li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation:+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures.">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li><li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching.">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li><li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices.">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li><li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity.">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li><li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Method+for+Mammalian+CNS+Neurons+in+Organotypic+Slice+Cultures.">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li><li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture.">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li><li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus.">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons.">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons.">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li><li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching.">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li><li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching.">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li></ol>

البروتوكول الحالي أيضا أداة قوية لدراسة الجوانب الإنمائية لتزايد محاور عصبية أخرى غير إسقاط ح11. على سبيل المثال، يسمح الجمع بين الثقافة شريحة القشرية وتقنية انهانسر تصور مورفولوجيا محواري الفردية من الخلايا العصبية القشرية وطويلة الأجل الملاحظة9،<sup class="x...

الإسقاط ثالاموكورتيكال (TC) في الدماغ الثدييات نظام مناسب للتحقيق في إرشادات إكسون واستهداف الآليات. خلال التنمية، وتنمو الحواس TC محاور عصبية في لوحة القشرية، وفروع النموذج ونهايات تفضيلي في طبقة الرابع الابتدائي المناطق الحسية في قشرة الدماغ1،2. حتى بعد إقامة اتصالات أساسية، يتم تشكيلها محواري العرش ومحطات متشابك تبعاً للتغيرات البيئية3،4. ومع ذلك، غير هو مفهومة كيف يتم تبديل مورفولوجيا إكسون TC بشكل حيوي. أحد الأسباب الرئيسية هو عدم وجود أسلوب كافية لمراقبة التغيرات الهيكلية على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري، مثل الفحص المجهري اثنين-فوتون، السماح للمراقبة المباشرة لمعيشة الخلايا العصبية القشرية في فيفو، هناك قيود لا تزال التقنية للالتقاط الإجمالي TC المسارات5، 6-ولذلك، أساليب في المختبر لتصوير مباشر من محاور عصبية TC سيوفر أدوات قوية لتحليلات الهيكلية لتشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
مجموعتنا للمرة الأولى إنشاء أسلوب ثقافة شريحة ثابتة مع نفاذية الأغشية7. باستخدام هذا الأسلوب، كان كوكولتوريد شريحة القشرية الفئران مع كتلة ثالاميك حسية، وقد لخص الصفيحة الخاصة TC اتصالات في هذا7،كوكولتوريس أورجانوتيبيك8. كذلك وسم متفرق مع بروتين فلوري سمح لنا بمراقبة نمو إكسون TC وفرع تشكيل9،،من1011. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتصوير المتزامن التفريع والمشبك تشكيل محاور عصبية TC الفردية في أورجانوتيبيك كوكولتوريس12. تصور TC محاور عصبية ومواقع بريسينابتيك في نفس الوقت، كانت دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك انهانسر كوكولتوري أورجانوتيبيك. الأسلوب الحالي يسهل تحليل الخصائص المورفولوجية لمحاور عصبية TC ويسمح بالمراقبة الطويلة الأجل، التي يمكن أن تستخدم لإظهار العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.

<table style="border-collapse:collapse;width:344pt" width="459">
	<colgroup>
		<col style="width:113pt" width="151" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:58pt" width="77" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">DMEM/F12</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">GIBCO</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">11320-033</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Hanks&#8217; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nissui</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">5905</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SH30396-03</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">Hyclone</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Insulin</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">I6634</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Progesterone</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">P8783</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Hydrocortisone</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">H0888</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Sodium selenite</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Wako Pure 
			Chemical Industries</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">192-10843</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Transferrin&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">T1147</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Putrescine&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">P5780</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Glucose</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Wako 
			Pure Chemical Industries</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">16806-25</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">35 mm petri dishes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Falcon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">351008</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Millicell-CM insert</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Millipore</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">PICMORG50</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">100 mm petri dishes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">BIO-BIK</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">I-90-20</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">petri dish sterrile</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Invitrogen</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">K210006</td>
			<td class="xl23" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="59" style="height:44.25pt">
			<td class="xl20" height="59" style="width:113pt;height:44.25pt" width="151">Disposable sterile plastic pipettes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">202-IS</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">transfer pipets sterile</td>
		</tr>
		<tr height="54" style="height:40.5pt">
			<td class="xl20" height="54" style="width:113pt;height:40.5pt" width="151">Glass capillary: OD 1.2 mm</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">&#160;G-1.2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">inner diameter, 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr height="53" style="height:39.75pt">
			<td class="xl20" height="53" style="width:113pt;height:39.75pt" width="151">Silver wire: 0.2 and 1 mm&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nilaco</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">1 mL syringe</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Terumo</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SS-01T</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Stimulator&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">A.M.P.I</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Master 8</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Biphasic isolator&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">BAK ELECTRONICS</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">BSI-2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Amplifier&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">A-M Systems</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Model 1800</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Oscilloscope</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Hitachi</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">VC-6723</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Manipulator</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SM-15</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Micromanipulator</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">MO-10</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SZ40</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Universal stand&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SZ-STU2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Light illumination system&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">LG-PS2, LG-DI, HLL301</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Electrode puller&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">PC-10</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Confocal microscope</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nikon</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Digital eclipse C1 laser</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">x20 objective</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nikon</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">ELWD 20x/0.45</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Culture chamber</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Tokai Hit</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">UK A16-U</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Sprague-Dawley (SD) rat</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Japan SLC and Nihon-Dobutsu</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Microsurgery scissors</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Natsume&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">MB-54-1</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures

تشكيل المتفرعة والمشبك إكسون هي العمليات الحاسمة لإنشاء دوائر الخلايا العصبية الدقيقة. خلال التنمية، وتشكل محاور عصبية حسية ثالاموكورتيكال (TC) فروع ونقاط الاشتباك العصبي في طبقات معينة من قشرة الدماغ. على الرغم من المكانية علاقة متبادلة واضحة بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك، هو غير مفهومة العلاقة السببية بينهما. لمعالجة هذه المسألة، ونحن مؤخرا بوضع طريقة لتصوير المتزامن لتشكيل محاور عصبية TC الفردية في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المتفرعة والمشبك.
ويصف هذا البروتوكول أسلوب الذي يتكون من مجموعة من كوكولتوري أورجانوتيبيك وانهانسر. كوكولتوريس أورجانوتيبيك من قشرة الدماغ والمهاد يسهل التلاعب بالجينات ومراقبة العمليات محواري، الحفاظ على هياكل مميزة مثل تكوين الصفحي. والبلازميدات مميزة اثنين ترميز دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) تم transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك بأسلوب انهانسر. هذه الطريقة سمحت لنا بتصور مورفولوجيس محواري الفردية TC الخلايا العصبية ومواقعهم بريسينابتيك في وقت واحد. كما مكن الأسلوب المراقبة الطويلة الأمد التي كشفت عن العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.

ووصف التجربة هنا يهدف إلى الكشف عن العلاقة بين تشكيل المتفرعة والمشبك إكسون TC. في نفس الوقت تصور مسارات محواري وموقعا من مواقع presynaptic، واحد أو عدد قليل من الخلايا ثالاميك في كوكولتوريس أورجانوتيبيك تم transfected مع اثنين والبلازميدات ترميز اجفب ليرة سورية ودسريد باستخدام ان?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures at JoVE.com

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

ويصف هذا البروتوكول طريقة لتصوير المتزامن ثالاموكورتيكال إكسون المتفرعة والمشبك تكوين في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المهاد وقشرة الدماغ. محاور عصبية ثالاموكورتيكال الفردية وعلى محطات presynaptic هي تصور بتقنية انهانسر خلية مفردة مع دسريد وسينابتوفيسين معلم التجارة والنقل.

التصور إكسون ثالاموكورتيكال المتفرعة والمشبك تشكيل في كوكولتوريس أورجانوتيبيك

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

The overall goal of this method is to study dynamic morphological changes of axon branching and synapse formation in the thalamocortical projection. This method can help answer key questions in the field of neurobiology, such as new neural circuit formation. The main advantage of this technique is simultaneous observation of axon growth and the synapse formation in individual living cells.This method can provide insight into the relationship between axon branching and synapse formation in the thalamocortical projections. It can also be applied to other neural circuits, such as intrinsic connection in the cerebral cortex. To begin this procedure, sterilize all the surgical instruments with 70%ethanol for 10 minutes or longer.Next, dissect the whole brain quickly from a postnatal day-two rat under ice-cold anesthesia. Then, place the brain into a 100-millimeter petri dish containing 40 milliliters of cold Hank's Balanced Salt Solution. Under a binocular microscope, remove the pia matter carefully with fine forceps, and cut the primary visual and somatosensory cortex into 300 to 400-micron thick slices using microsurgical scissors.After that, transfer the cortical slices onto the membrane filter of the culture insert using a disposable plastic pipette. Adjust the positions of the slices near the center of the culture insert with the disposable plastic pipette, and remove excess medium from the insert. Maintain the slices in the serum-containing culture medium at 37 degrees Celsius, and culture them alone for one day before placing a thalamic block from an E15 embryo next to it.Adjust the level of the medium slightly below the surface of the slice, so that the slices can receive sufficient supply of both the gas and the medium. This is crucial for the viability of the slices. In this step, make the glass capillaries with an electrode puller.Then break the tips of the glass capillaries for plasmid injection. For the electrode pipettes, grind and polish the tips of the glass capillaries with sandpaper. And then fire polish them to achieve an inner diameter of 50 to 200 microns.Next, attach the electrode pipette and the ejection pipette to the manipulators. Transfer five microliters of plasmid solution to a petri dish. Then draw the solution into the electrode pipette with capillary action.Insert the 0.2-millimeter diameter electrode into the electrode pipette. After connecting the ejection pipette to a one-milliliter syringe with a plastic tube, transfer five microliters of plasmid solution to a petri dish again. Then slowly draw the solution into the ejection pipette using the syringe.Following that, transfer the coculture on the electroporation stage and insert the one-millimeter diameter electrode into the culture medium. Subsequently, place the ejection pipette on the cultured thalamic block. Push the syringe manually after the tip touches the surface of the thalamic block.Place the electrode pipette on the thalamic block immediately after the retraction of the ejection pipette. Now, deliver the electrical pulses. Monitor the amplitude and the number of trains on the oscilloscope.Afterward, retract the electrode pipette and return the dish to the incubator. To observe the sample, place the culture dish on the stage of an upright confocal microscope equipped with two filter sets for EGFP and DsRed. Then take images of 10 to 25 optical sections, at one to seven-micron step sizes, with a 20x long working distance objective lens.Select individually-distinguishable labeled axons, which express both DsRed and Syp-EGFP. Shown here is an organotypic coculture of thalamic and cortical slices after 12 DIV. Here is a magnified image of the boxed region.And here is a DsRed-labeled thalamic cell extending an axon into the cortical slice, and forming branches in upper layers. These images show the DsRed-labeled thalamocortical axon and Syp-EGFP puncta. Discrete accumulation of Syp-EGFP was observed along a single thalamocortical axon.DsRed plus Syp-EGFP plasmids were introduced into cultured thalamic cells at one DIV using electroporation. This axon was imaged daily over four days. Axon branching and synapse formation were dynamic, with addition and elimination.Following these procedures, electroporation with interesting genes together with Syp-EGFP and DsRed can be performed in order to investigate the role of the gene in axon branching and synapse formations. This technique paves the way for researchers in the field of the neurobiology to explore the mechanisms of dynamic changes of neural circuits.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

المؤتمتة عرض الفيديو التفاعلي للدراسات الاتصالات الحيوانية

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

المثبطة تشكيل المشبك في الثقافة المشارك نموذجي يتضمن المتوسطة GABAergic شائك الخلايا العصبية وخلايا HEK293 وإذ يعرب ستابلي GABA<sub&gt; و</sub&gt; المستقبلات

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

رباعية المناعية من لمبة الشمية لتصور رموز حسية أكسون الجزيئية الحسية

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

تحسين تطبيق أمين ديكستران بيوتينيلاتيد عالية الوزن الجزيئي للإسقاط ثالاموكورتيكال تتبع في الفئران

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...