Name: pentylenetetrazole-induced kindling mouse model
Uploaded: 2018-06-12T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por números de concesión JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 y 17 K 07086, números de concesión MEXT KAKENHI 25110737 y 23110525, AMED concesión número JP18ek0109311 y la Fundación de investigación médica de un y el Japón Fundación de investigación de la epilepsia.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso de la Tokyo Metropolitan Instituto de ciencias médicas. 8 postnatal - ratones de 16 semanas de edad se recomiendan. Cualquier cepa consanguínea es aceptable para el experimento. Ratones C57BL/6 son más resistentes a PTZ, que ratones albinos BALB/c y Suiza son más sensibles a PTZ. C57BL/6 fueron utilizados en este estudio. Vulnerabilidad a PTZ también depende de la edad del ratón. En comparación con ratones pequeños, ratones más ...

Aquí, presentamos un protocolo ampliamente accesible para el establecimiento de un modelo farmacológico de la epilepsia. Inflamación química mediada por PTZ tiene una larga historia y es un modelo comúnmente aceptado para el estudio de la patología celular y la histopatología de epilepsia41. El modelo de inflamación química de la epilepsia ha sido revisado previamente por Suzdak y Jansen, 199542. Inducción de convulsiones farmacológicas, especialmente con PTZ, es...

La epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por convulsiones recurrentes y afecta aproximadamente al 1% de las personas. Los mecanismos subyacentes de generación epileptogénesis y convulsiones en pacientes con epilepsia no pueden ser totalmente clarificados en estudios clínicos. Por lo tanto, un modelo animal apropiado es necesario para el estudio de la epilepsia1.
Una gran variedad de modelos animales de epilepsia se han utilizado para investigar la fisiología de la epilepsia y para identificar los fármacos antiepilépticos2,3. Entre estos modelos, la inducción de convulsiones farmacológicas es un método común utilizado para generar un modelo animal para la investigación de la patología de la epilepsia4. Este método es barato y simple. Inflamación mediada por electrodo es también un método comúnmente utilizado, pero los costos de este procedimiento son más altos, y el método requiere habilidades quirúrgicas y eléctricos para inducir convulsiones repetitivas5.
Inducción farmacológica también es ventajosa porque el tiempo y el número de convulsiones se controlan fácilmente. Modelos de ratón genético que presentan convulsiones espontáneas también se utilizan en el estudio de la epilepsia. Sin embargo, la predicción de Cuándo y con qué frecuencia las convulsiones se presentan en estos modelos genéticos puede ser imposible6. Un sistema de seguimiento es necesario para observar el comportamiento epiléptico de ratones modificados genéticamente6.
Ácido kaínico, la pilocarpina y la pentylenetetrazole (PTZ) son ampliamente utilizados como inductores de incautación drogas7. El Ácido kaínico es un agonista de los receptores de glutamato, y pilocarpina activa los receptores colinérgicos. PTZ es un ácido gamma aminobutírico (GABA)-un antagonista del receptor del8. PTZ suprime la función de las sinapsis inhibitorias, una mayor actividad neuronal. Presente Reglamento causa asimientos generalizados en animales9. Una sola inyección de Ácido kaínico y pilocarpina puede inducir convulsiones agudas, especialmente status epiléptico (SE)10,11 y kaínico ácido o pilocarpina-mediada SE promueve crónica espontánea y recurrente asimientos12 , 13. las grabaciones electroencephalographic (EEG) y análisis de la conducta han indicado que las crisis recurrentes espontáneas se observan un mes después de una sola inyección12,13. Una sola inyección de una dosis convulsiva de PTZ también induce crisis aguda. Sin embargo, asimientos crónicos espontáneos después de una inyección única de PTZ son difíciles de promover. La administración crónica de PTZ es necesaria para inducir convulsiones repetitivas14. En cualquiera de los métodos, la generación de convulsiones repetitivas es capaz de inducir una patología más similar a la de la epilepsia humana que la generación de convulsiones agudas. En el caso de PTZ, cada inyección evoca una convulsión, y severidad de la crisis se convierte en más grave en una manera paso a paso con cada inyección. Por último, una sola inyección de PTZ de dosis bajas induce una severa convulsión tónico-clónica. En esta fase, cada inyección evoca las convulsiones severas. Además, la latencia de la convulsión y la duración también cambian en el transcurso de las inyecciones. La latencia a asimiento tónico se convierte a menudo más corta en esta última fase de inflamación15. Además, agravamiento de la convulsión se acompaña de una convulsión prolongada duración16. Investigar el mecanismo molecular que regula la gravedad de la crisis, latencia y duración es útil para la detección de drogas antiepilépticas17,18,19.
Comúnmente los asimientos son inducidos por una sola administración sistémica de PTZ y la recuperación es muy rápida, dentro de 30 min4,5. Así, el número de las convulsiones es más controlable en el modelo PTZ-astillas. Sin embargo, la supervisión de EEG ha indicado que pueden verse picos generalizadas hasta 12 h después de PTZ-medió incautación20. Por lo tanto, los animales preferiblemente deben permanecer bajo observación durante 24 h después de las convulsiones mioclónicas o tónico21 para análisis más preciso de los mecanismos de inflamación.
La administración de los fármacos antiepilépticos, como la etosuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina y retigabine3, antes o después de la inyección de PTZ mitiga el agravamiento de la convulsión severidad3,22, 23. Asimismo, ratones knockout que falta genes implicados en la exacerbación de convulsiones, como matriz metaloproteinasa-924,25 y neuritin FGF-2226, han demostrado exhibir convulsiones reducida gravedad después de inyecciones múltiples de PTZ. Además, observando alteraciones histopatológicas después de las crisis epilépticas es posible con este método. En pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, hay cambios histológicos típicos en el cerebro, como la fibra musgosa brotación27,28, gránulo anormal neurona migración29, astrogliosis30, células neuronales muerte en el hipocampo31,32y esclerosis hipocampal33. Cambios similares se observan en animales epilépticos modelo. Entre los métodos disponibles, inflamación química mediada por PTZ es un método bueno, reproducible y barato para producir un modelo animal de epilepsia. En un modelo SE mediada por pilocarpina, control de las convulsiones es difícil y muchos ratones mueren o no a desarrollar SE34. En contraste, la mortalidad y la gravedad de la crisis son más controlables en el modelo PTZ. Además, PTZ es menos costoso que el Ácido kaínico y habilidades en cirugía de cerebro de ratón no son necesarios para la administración de la droga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) es un antagonista del receptor GABA-A. La inyección intraperitoneal de PTZ en un animal induce una convulsión aguda, severa a una dosis alta, mientras que las inyecciones secuenciales de una dosis de subconvulsive se han utilizado para el desarrollo de la química, Yesca, un modelo de epilepsia. Una sola inyección de dosis bajas de PTZ induce una convulsión leve sin convulsión. Sin embargo, repetidas inyecciones de dosis bajas de PTZ disminuyen el umbral para evocar un ataque convulsivo. Por último, la administración continua de dosis bajas de PTZ induce una severa convulsión tónico-clónica. Este método es simple y ampliamente aplicable a investigar la patofisiología de la epilepsia, que se define como una enfermedad crónica que involucra convulsiones repetitivas. Este producto químico Yesca protocolo causa convulsiones repetitivas en animales. Con este método, se estimó la vulnerabilidad a ataques de PTZ-mediada o el grado de agravación de las crisis epilépticas. Estas ventajas han llevado a la utilización de este método para la detección de drogas antiepilépticas y genes relacionados con la epilepsia. Además, este método se ha utilizado para investigar daño neuronal después de ataques epilépticos debido a los cambios histológicos observados en los cerebros de pacientes epilépticos también aparecen en los cerebros de animales encendido química. Así, este protocolo es útil para la producción conveniente de modelos animales de epilepsia.

Inyección repetitiva de PTZ induce un aumento en la severidad de convulsiones. Seis ratones C57BL/6 fueron tratados con PTZ, y otro 6 ratones fueron tratados con solución salina como grupo de control. La dosis PTZ fue de 35 mg/kg, y 10 inyecciones fueron administradas. La puntuación de ataque aumentó gradualmente con inyecciones de PTZ, considerando que no hay ataques o comportamientos anormales fueron evocados por las inyecciones de solución Salinas (figura 2</s...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Este protocolo describe un método de química inflamación con pentylenetetrazole y proporciona un modelo de ratón de la epilepsia. Este protocolo también puede utilizarse para investigar la vulnerabilidad a la inducción de convulsiones y de la patogenesia después de las crisis epilépticas en los ratones.

Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

This method can help the deep analysis of epilepsy. Seizure will induce histological changes in the brain which may be involved in the neuropsychiatric developmental disorders. The main advantage with this technique is that self-conversive dose of PTZ can induce controllable seizures better than the other current methods.Begin preparing the injection by dissolving 2 milligrams per milliliter PTZ in sterile 0.9 percent sodium chloride. Weigh the animal, then place it in an observation chamber for a 3-minute habituation period. Next, inject PTZ interperitoneally with a 1 milliliter syringe attached to a 27 gauge needle into the left or right quadrant of the abdomen of the animal.Finally, observe the animal after PTZ injection for abnormal behavior. Obtain at least two two-to-six month old 129 SV mice who are of the same sex as the subject mice to be the stranger mouse. Each stranger mouse must be kept separately.For each training session, leave the mouse in the cage for habituation for 15 minutes. Clean the entire apparatus in both cages by wiping the surface with 70%ethanol. Then, place the empty cages in the two side chambers of the three-chamber apparatus and open the doors between the chambers.To habituate the subject mouse, place the subject mouse in the center chamber and allow the mouse to move freely throughout the apparatus until the mouse has investigated both cages, plus an additional five minutes. After the animal moves into the center chamber, close the doors and let the mouse move freely in the center chamber for five minutes. During this period, put one of the 129 SV mice in a cage to habituate to the cage.Immediately after the habituation period of the subject mouse, place the cage containing the 129 SV mouse, termed the Stranger One cage, in one of the side chambers and place the empty cage, termed the Object cage, in the other side chamber. Open the door and monitor the behavior of the subject mouse. Allow the subject mouse to move freely for 10 minutes and record four behavioral parameters.Number one, the time spent in each chamber, the Stranger One chamber, the Object chamber and the center chamber. Number two, time spent investigating each cage, the Stranger One cage and the Object cage. Number three, the number of entrances into each chamber and Number four, the total distance traveled.After the mouse moves into the center chamber, close the doors. After wiping the cages, begin the social novelty analysis by placing another 129 SV mouse in one of the cages, termed the Stranger Two cage, and place the Stranger Two cage in one of the chambers. Place the Stranger One mouse in the other cage, termed the Stranger One cage and place the Stranger One cage in the other chamber.Finally, open the door and monitor the behavior of the subject mouse. Allow the subject mouse to move freely for 10 minutes and measure the same behavioral parameters described for the sociality analysis. Begin by placing a mouse in a conditioning apparatus with specific conditions.For example, a square apparatus with clear plexiglass walls, a metal grid floor, an ethanol odor, 100 lux brightness and 65 decibel background white noise. Condition the mouse by foot shock with pseudo-random timing of a 0.1 milliamp electrical shocks for two seconds three times over the course of five minutes. Then, return the mouse to the home cage after conditioning.The day after conditioning, perform a memory assessment by placing the mouse into the same apparatus as the shock condition and measuring the freezing time over the course of five minutes. Later the same day, place the mouse in a novel apparatus and measure the freezing time during a five-minute assessment. Finally, compare the freezing time between the same condition and novel condition.Results indicated that the seizure score gradually increased with PTZ injections, whereas no seizures or abnormal behaviors were evoked by saline injections. Further, repetitive seizure promoted aberrant axonal branch formation or mossy fiber sprouting and abnormal migration of granule cells in the hippocampus. PTZ-treated mice showed normal sociality.Mice spent more time in the Stranger One chamber than in the Object chamber and investigated the Stranger One cage more than they investigated the Object cage. PTZ-treated mice showed abnormal social novelty, indicative of impaired social memory. PTZ-treated mice also showed impaired memory in the contextual fear test.Following this procedure, other methods like Morris water maze or the other memory tests can be performed to answer the additional questions about the impaired memory ability affected by epileptic seizure. After its development, this technique paves the way for the researchers in the field of epilepsy to explore as a mechanism of seizure-induced neuropsychiatric developmental disorders by using model animals.

Research

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