Name: analyzing the communication between monocytes and primary breast cancer cells in an extracellular matrix extract (ecme)-based three-dimensional system
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System at JoVE.c

Эта работа было поддержано КОНАСИТ FONSEC SSA/ИМСС/ИСОГС проекта № 233061 до Эсекьель м. Фуэнтес-Pananá и по Fondo de Apoyo а-ля инвестигасьон, больница Infantil де Мехико Федерико Гомес (номер проекта HIM-2014-053). Эспиноса-Санчес NA является докторантом из Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma де Мехико (UNAM) и получил стипендий 231663 от КОНАСИТ. E-S NA, также признаем финансовую поддержку, оказываемую Мексиканского института социального обеспечения (мисо).

Образцы из BrC пациентов были получены из ткани банка Unidad de Investigación en Virología y стрессовые, больница Infantil де Мехико Федерико Гомес. Это исследование было одобрено научным, этические и биозащищенности обзора доски Гомес Федерико больницы Infantil де Мехико: Comité de Investigación, этика Comité de en инвестига...

<ol>
	<li>Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+understanding+tumor+hierarchy+and+heterogeneity.">Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity.</a> Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+microenvironment+in+tumorigenesis.">Role of tumor microenvironment in tumorigenesis.</a> J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Sica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+tumour+progression.">Macrophage polarization in tumour progression.</a> Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).</li><li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology.">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Debnath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+apoptosis+in+creating+and+maintaining+luminal+space+within+normal+and+oncogene-expressing+mammary+acini.">The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini.</a> Cell. 111 (1), 29-40 (2002).</li><li>Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2,+but+not+ErbB1,+reinitiates+proliferation+and+induces+luminal+repopulation+in+epithelial+acini.">ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini.</a> Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).</li><li>Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteolysis:+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis.">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).</li><li>Sameni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAME+models+for+4D+live-cell+imaging+of+tumor:+microenvironment+interactions+that+impact+malignant+progression.">MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protease+activity+in+living+cells:+from+two+dimensions+to+four+dimensions.">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).</li><li>Chimal-Ramirez, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP1,+MMP9,+and+COX2+expressions+in+promonocytes+are+induced+by+breast+cancer+cells+and+correlate+with+collagen+degradation,+transformation-like+morphological+changes+in+MCF-10A+acini,+and+tumor+aggressiveness.">MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness.</a> Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).</li><li>Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta,+IL-8,+and+Matrix+Metalloproteinases-1,+-2,+and+-10+Are+Enriched+upon+Monocyte-Breast+Cancer+Cell+Cocultivation+in+a+Matrigel-Based+Three-Dimensional+System.">IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System.</a> Front Immunol. 8, 205 (2017).</li><li>Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+promotes+stemness+and+invasiveness+of+colon+cancer+cells+through+Zeb1+activation.">IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation.</a> Mol Cancer. 11, 87 (2012).</li><li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblotting+and+immunodetection.">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+of+metalloproteinases.">Zymography of metalloproteinases.</a> Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).</li><li>Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+CagA+and+IL-1beta+Promote+the+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+a+Nontransformed+Epithelial+Cell+Model.">Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model.</a> Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).</li><li>Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+and+fibroblast+growth+factor+receptor+1+cooperate+to+induce+cyclooxygenase-2+during+early+mammary+tumourigenesis.">Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis.</a> Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+(EGF)+and+interleukin+(IL)-1beta+synergistically+promote+ERK1/2-mediated+invasive+breast+ductal+cancer+cell+migration+and+invasion.">Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion.</a> Mol Cancer. 11, 79 (2012).</li><li>Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+B-cell+and+viral+ITAM+signaling:+context+is+everything.">Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything.</a> Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).</li><li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research.">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).</li><li>Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogels+-+Versatile+Matrices+for+3D+Cell+Culture+in+Cancer+Medicine.">Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine.</a> Front Oncol. 5, 92 (2015).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Pompaiah, M., Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+Organoids:+An+Emerging+Model+System+to+Study+Helicobacter+pylori+Pathogenesis.">Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).</li></ol>

Эпителиальные клетки растут в 3D пространственной конформации и их взаимодействие с белками ECM является ключевой для ткани гомеостаза. Многие исследования рака были основаны на клетки, выращенных в монослои (2D) и хотя они решающее значение для понимания многих аспектов образования опух...

Биология опухоли является гораздо более сложной, чем считалось ранее. Монтаж доказательств показывает, что опухолевые клетки более чем просто массовая неконтролируемая пролиферирующих клеток; скорее различные неопластических клеток, по-видимому, выполняют различные функции отображения высокой Организации и иерархия в пределах опухоли1. Опухолевые клетки находятся также в интимной связи с не трансформированных клеток: макрофаги, фибробласты, лимфоцитов, адипоциты, эндотелиальные клетки, среди других клеток все погружены в эшафот белки и полисахариды, которые составляют ECM. Многочисленные прямые и косвенные взаимодействия устанавливаются между преобразуется и -трансформированных клеток и с ECM, который оказывает мощное влияние на результат болезни2,3. В конкретном случае BrC особенно важно вскрыть связи BrC клеток с ТАМС, считая, что ТАМС были найдены играть решающую роль в развитии опухоли, увеличивая риск метастазов и рецидивов болезни4 ,5.
Для анализа интра опухолевой взаимодействий и их возможные результаты, новые 3D в vitro подходы были разработаны основанные на использовании ECM экстрактов, которые обеспечивают гораздо более сложные микроокружения, ближе к реальности опухоли биологии, в сравнении с обычные однослойные клеточных культур, в которых клетки растут придает пластика. Петерсен и Bissell6 первая модель доброкачественные и Злокачественные эпителиальные клетки молочной культивированный на базальной мембраны Ламинин богатые и были первыми для описания структуры 3D organotypic, дискриминационные доброкачественные человека эпителиальных клеток молочной железы от их злокачественные коллегами. Десять лет спустя, модель, разработанная Debnath, Мутусвами, и Брюгге7,8,9 предоставляет ценный инструмент для выяснения биологические пути во время злокачественной трансформации железистой ацинусов, такие как большой Ацинусы образование из-за бесконтрольного распространения, делокализация туго Джанкшен белков как доказательства нарушения клеток поляризации и потеря Ацинусы люмен результате ячейки сопротивления anoikis, тип запрограммированной смерти клетки, происходит в Анкоридж зависимых клеток, когда они отсоединить от окружающих ECM. Модели Sameni, Jedeszko и Слоун были сосредоточены на визуализации протеолитической активности клеток, которая тесно связана с инвазивность, другой решающую черта опухоли злокачественными опухолями10,,1112. Эти модели полагаются на белок матрицы, смешанного с различными закаленном флуоресценции белков субстратов (DQ-желатин, DQ-коллаген I и IV DQ-коллаген), в котором флуоресцентные сигналы являются ориентировочными протеолитических деградации коллагена. 3D модели используются также для изучения свойств стволовых клеток как-трансформированных и опухолевые клетки, в котором ячейки агрегатов, также называют сфероидов, может быть культивировали, подвеска или в ECM-подобных белков, допрос механизмы дифференцировки клеток, асимметричные деление клеток, присоединение к ячейке и клетки моторики13,14. Вторжения анализы позволяют тестирование внутренней агрессивность опухоли и выявление молекулы, которые служат в качестве chemoattractants в ходе инвазивные процесс15. В целом, 3D модели представляют доступные диверсификации в пробирке клеток культуры, которая более тесно отразить нормальной и онкогенных ткани морфогенеза.
Мы разработали 3D клетки совместно культуры системы, основанной на вышеупомянутых моделей7,10,11, используя оба человека коммерческие BrC клеточных линий, известных агрессивный потенциал (люминал и тройной негативного типы) и первичной клетки, описаны из BrC пациентов. Мы впервые разработал модель, где неагрессивных (MCF-7) или агрессивным BrC (MDA-MB-231) клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в выписку внеклеточного матрикса (ECME)-на основе 3D-системы, которая позволила прямой ячеек взаимодействий. Эти совместно культур были использованы для определения, как связь между этими двумя клеток линий влияние транскрипции набор генов, связанных с агрессивным поведением рака. Значительное увеличение числа Стенограмма циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) было отмечено, что совпало с увеличение производства одного из своих продуктов, простагландин E2 (PGE2), вывод, который подчеркнул роль воспаления в прогрессии рака. Увеличение транскрипции ММП также было отмечено, что коррелирует с больше коллагена протеолиза при агрессивных MDA-MB-231 клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в DQ-коллаген IV-содержащих культур. Следует отметить нашего совместного культур не поддерживает предположение, что механизмы взаимодействия клеток необходимы для деградации коллагена. Скорее, он предложил, что связь между двумя клеток линий был посредничестве секретируемые молекул. Кроме того supernatants, добываемых из этих анализов совместно культуры содержится растворимых факторов, которые дезорганизованы железистой ацинусов, образованный-трансформированных клеток MCF-10A13. Было установлено, что агрессивный и первичных клеток BrC выделяется повышенный уровень Моноцит эозинофилов молекул MCP-1, ГМ-КСФ и RANTES. Таким образом мы изложили 3D культуры, в которой клетки были отделены в ячейку культуры вставок для предотвращения взаимодействия ячеек. Эти культуры были использованы для решения непрямая связь между BrC клетки и моноцитов. Для этих анализов, неагрессивных и агрессивных коммерческих BrC клеточных линий и первичных клеток BrC и три различных типов человека моноциты: коммерческая U937 и THP-1 клетки и первичной моноцитов (PMs), изолированных от периферической крови здоровых доноров (все Моноциты были использованы в государстве не активирована) были использованы. Увеличение концентрации цитокинов ИЛ 1β и IL-8 были замечены обогатиться в сотрудничестве культуры. Аналогичным образом было установлено, что MMP-1, ММП-2 и MMP-10 также были увеличены в BrC клетки Моноцит совместно культур и таким образом укрепления предыдущие выводы14. В этой рукописи точка за точкой процесса первичной изоляции клетки BrC и тестирования в 3D культур представлен наряду с представителем результаты. Эта работа является хорошим примером того, большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают опрос конкретных аспектов опухоли биологии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1108px;" width="1108">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">U937</td>
			<td style="width:260px;">American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CRL-1593.2</td>
			<td style="width:463px;">Monocytic cell line/histiocytic lymphoma&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">THP-1</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">TIB-202</td>
			<td>Monocytic cell line/acute monocytic leukemia&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCF-10A</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Non-transformed breast cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCF-7</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-22</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">T47D</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-133</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HS578T</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-126</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-26</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11964-092</td>
			<td>4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td>100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 0.25 &#181;g/mL Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Horse serum&#160;</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.05% Trypsin-EDTA 1X</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X (Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15 (1.00mg)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H088-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholera toxin Vibrio cholerae</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>356237</td>
			<td style="width:463px;">Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20&#176;C until use at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCP-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">RANTES</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IL-8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IL-1&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Crystal-violet</td>
			<td>Hycel M&#233;xico</td>
			<td>541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transwell permeable supports (inserts)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td style="width:143px;">3422</td>
			<td>6.5 mm diameter, 8 &#181;m pore size/24-well plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transwell permeable supports (inserts)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">140620</td>
			<td>6.5 mm diameter, 0.4 &#181;m pore size/24-well plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Monocyte Isolation Kit II Human&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:143px;">130-091-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LS Columns</td>
			<td style="width:260px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:143px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:143px;">HCYTOMAG-60K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)</td>
			<td style="width:260px;">Luminex Corporation</td>
			<td style="width:143px;">40-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)</td>
			<td style="width:260px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:143px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass bottom microwell 35mm petri&#160; dishes</td>
			<td style="width:260px;">MatTek Corp.</td>
			<td style="width:143px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the communication between monocytes and primary breast cancer cells in an extracellular matrix extract (ecme)-based three-dimensional system

Встроенные в внеклеточного матрикса (ECM), нормальных и опухолевых клеток эпителия тесно общаться с кроветворную и не гемопоэтических клеток, таким образом значительно влияющих на нормальные ткани гомеостаза и болезни результатов. В рак молочной железы связанный тумором макрофагов (ТАМС) играют важную роль в прогрессирования заболевания, метастазов и рецидивов; Таким образом понимание механизмов Моноцит chemoattraction микроокружения опухоли и их взаимодействия с опухолевых клеток имеет важное значение для борьбы с этим заболеванием. Здесь мы предоставляем подробное описание системы трехмерного (3D) совместно культуры молочной железы человека клетки рака (BrC) и человека моноцитов. BrC клетки производятся высокий базальный уровень регулируемую активацию, нормальный Т-клеток выражена и выделяется (RANTES), Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), в то время как в со культуре с моноцитов, Интерлейкин (IL) -1 бета провоспалительных цитокинов (ИЛ 1β) и ИЛ-8 обогатились вместе с матрицы металлопротеиназ (СПП) -1, ММП-2 и MMP-10. Этот микроокружения опухоли стромы поощрять устойчивость к anoikis в ККМ 10A 3D Ацинусы как структуры, chemoattraction моноцитов и вторжения агрессивных клеток BrC. Здесь представлены протоколы предоставляют доступную альтернативу изучать коммуникации внутри опухоли и являются примером большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают допросить особенностей опухоли биологии, относящиеся к опухоли агрессии.

Морфологический анализ BrC клеток в 3D культур:
Морфология первичных клеток BrC, растущих в 3D культур при низкой и высокой плотности было исследовано более 5 дней. В течение первых 48 часов клетки придерживаться ECME и поддержания низ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System at JoVE.c

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Анализируя связь между моноцитов и первичных груди раковые клетки в внеклеточного матрикса экстракт (ECME)-на основе трехмерной системы

Здесь мы описываем трехмерной культуры метод для анализа морфологии первичных груди раковых клеток, а также изучение их прямое/косвенное взаимодействие с моноцитов и исходы, такие как деградация коллагена, набора иммунных клеток, клеток вторжения и поощрение связанных с раком воспаления.

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

The overall goal of this protocol is to study the direct and indirect communication between primary breast cancer cells and monocytes in a three-dimensional co-culture system. This method can help answer key questions in inflammatory microenvironment of breast cancer field such as how immune cells are regraded and activated, how these cells help to sustain the tumor inflammatory microenvironment and how these microenvironment facilitates tumor cell invasion. The main advantage of this technique is that it provides an affordable alternative to study intra-tumor communication and illustrates the potential of in vitro, 3-D cell systems for interrogating specific features of tumor biology.Particularly those related to tumor aggression. To begin, cultivate two times 10 to the sixth U937 and THP1 monocytes in 10 milliliters of RPMI1640 medium, supplemented with 10 percent FBS and one percent antibiotic antimycotic. Also cultivate fresh PMs in supplemented DMEMF12 medium.Incubate the cells at 37 degrees Celsius in a humidified five percent carbon dioxide environment. Plate four time 10 to the fifth monocytes in one milliliter per well of their corresponding medium. Place an insert in each well and add 900 microliters of the four times 10 to the fifth BrC cell suspension in the corresponding medium.Incubate the cultures at 37 degrees Celsius in a humidified five percent carbon dioxide environment for five days and recover the supernatants. Retrieve the cells by trypsinization if subsequent analysis is performed. Include controls of individual cell cultures with the respective media.To label BrC cells and monocytes with commercially available cumerine and rhodamine before cell culture, prepare a monolayer of two times 10 to the sixth BrC cells of interest and replace the standard medium with sufficient, pre-warmed working solution of the fluorescent dye. Incubate the cells at 37 degrees Celsius in a humidified five percent carbon dioxide environment for 30 minutes. Then aspirate the dye solution and use sufficient one XPBS to gently rinse the cells.Aspirate the PBS and add the standard medium. To trypsinize the cells, add two milliliters of 05 percent trypsin and 0.48 millimolar EDTA to the flask and incubate the cells at 37 degrees Celsius for five to 10 minutes. Add 200 microliters of FBS to stop the trypsinization and seven milliliters of the corresponding medium without supplements.Re-suspend the cells by pipetting, then transfer 10 microliters of the cells to a Nuebauer chamber and count them. Next, pellet the cells at 430 times g and room temperature for five minutes, then discard the supernatant and use three milliliters of pre-warmed fluorescent dye working solution to re-suspend the cells. Incubate the cell suspension at 37 degrees Celsius in a humidified five percent carbon dioxide environment for 30 minutes.After pelleting the cells again, discard the dye working solution and use five to seven milliliters of one XPBS to gently re-suspend the cells. Then, after pelleting the cells once more and discarding the PBS, re-suspend the cells in five to seven milliliters of standard medium. Count 10 microliters of the cell suspension.Set up a co-culture by spreading enough ECME at the bottom of the well to form an even layer in each well of a four well chamber slide system. Plate 20 microliters of a single cell suspension containing five time 10 to the fifth labeled BrC cells per well. After 15 to 20 minutes at 37 degrees celsius, add a suspension of 2.5 times 10 to the fifth labeled monocytes in 80 microliters of assay medium supplemented with 60 percent ECME.Allow the ECME to solidify at 37 degrees Celsius for 15 to 20 minutes. Now add one milliliter of a one to one mixture of the BrC cells and monocyte culture medium. Incubate the co-cultures at 37 degrees Celsius in a humidified five percent carbon dioxide environment for 24 hours, 48 hours, or five days to track changes at different time points.To degrade the ECM proteins and recover the cells from the cultures, aspirate and discard the medium, then add 0.5 milliliters of one XPBS with 0.1 percent trypsin and 0.25 percent EDTA to the culture. Incubate the cells at 37 degrees Celsius for three hours. Following the incubation, add 0.5 milliliters of one XPBS with 10 percent FBS to neutralize the trypsin and re-suspend the cells by vigorously pipetting to attain a single cell suspension.After pelleting the cells, discard the supernatant and re-suspend the cells in five milliliters of one XPBS with 10 percent FBS. Repeat this step once. Subject the cell suspension to fax with the appropriate instrument.Ensure that the final populations are at least 95 percent pure. In each well of an eight well chamber slide system spread a 40 microliter base of ECME and let it solidify at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Seed 800 MCF10 A cells per well in 400 microliters of supplemented DMEM F12 culture medium according to the text protocol.Then add 400 microliters of conditioned medium or supplemented DMEM F12 culture medium with 20 nanograms per milliliter of human recombinant IL1 beta. Place the chamber slide into a glass petri dish containing a 35 milliliter petri dish filled with two milliliters of PBS. The MCF 10A cells should be seeded in each well very slowly to avoid damage of the base of ECME and to prevent cells from settling down and forming a monoly.Using an optical microscope record glandular acini formation every 24 hours for 14 days. After 14 days of culture, add 100 microliters of 100 nanomolar dapy in one XPBS and incubate the samples at room temperature with constant stirring for 25 minutes. Rinse the samples with one XPBS at room temperature, three times for five minutes each with constant stirring.Use mounting medium specific for fluorescent staining to mount the preparations. Then seal the mounted samples with transparent polish and maintain the slides, protected from light at four degrees Celsius. Demonstrating the procedure in the confocal microscope will be Vadim Perez, a researcher from The National Laboratory of Advanced Microscoping.Analyze the acini with a confocal microscope taking images of transversal stacks at different depths of the acini. Visualize different cellular proteins in the acini with proper staining protocols. For example, caheren was stained here to assess cell to cell adhesion, cell polarity, and oralimen formation.The morphology of primary BrC cells growing in 3D cultures at low and high densities was studied over five days. During the first 48 hours, cells adhere to the ECME with an elongated spindle shape and form knit-like structures at five days. After five days in 3D co-cultures, both MCF7 and MDA-MB-231 commercial BrC cells formed disorganized aggregates.However, aggressive MDA-MB-231 cells for aggregates with elongated forms, while non-aggressive MCF7 cells for aggregates with rounded shapes that are more densely compacted then MDA-MB-231 cells. The supernatants from indirect interaction 3D primary BrC cultures and their five day co-cultures with primary monocytes were harvested. Significantly increased levels of IL1 beta and IL8 were observed in the primary BrC cell monocyte co-cultures.Both crucial and flammatory cytokines that have been previously associated with malignant progression. MCF10A cells were cultivated with two different supernatants from two primary BrC cell lines to observe lumen formation as a measure of resistance to anoykis. Unlike MCF10A cells grown under standard conditions, bi-confocal microscopy at day 14, transversal cuts of the spheroids show that MCF10A cells evaded anoykis as measured by counting the number of central cells in the acini.Following this procedure, other methods like medical analysis can be performed in order to answer additional questions. Test the signaling pathways in both cancer migration. After its development this technique paved the way for researchers in the field of tumor micro-environments to explore the communications of breast cancer cells with mass cells, fibroblasts, neutrofils, or even different clones of tumor cells in 3D co-culture systems.After watching this video, you should have a good understanding of how to establish a 3D culture system to model the tumor microenvironment.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Захват малые молекулы связь между тканей и клеток с использованием изображений масс-спектрометрия

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Дифференциация мышиной груди Эпителиальная HC11 и EpH4 клетки

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...