Name: multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Labex Immuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET), Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Parigi Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET). EdG è stato finanziato da una borsa di studio della Fondation ARC. EV e CD sono stati finanziati da un sodalizio di APHP (bourse année recherche). ChB è finanziato da una borsa di studio dell'Université Sorbonne Parigi Cité (contrat doctoral). Gli autori ringraziano la Bristol Myers Squibb per il loro finanziamento in questo progetto. Gli autori ringraziano il reparto di patologia dell'Hôpital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Gli autori ringraziano la piattaforma di istologia del PARCC, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consenso informato è stato ottenuto dal partecipante incluso nelle coorti.
1. tessuto materiale
<ol><li>Raccogliere campioni di tessuto RCC il giorno dell'intervento. Gestire l'esemplare chirurgico a temperatura ambiente (reparto di patologia).</li>
	<li>Raccogliere un campione di tumore di circa 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taglia i...

<ol>
	<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy:+Rational+and+recent+breakthroughs.">Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs.</a> Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).</li><li>Motzer, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma:+Results+of+a+Randomized+Phase+II+Trial.">Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial.</a> J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+in+previously+untreated+melanoma+without+BRAF+mutation.">Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation.</a> N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipilimumab+plus+dacarbazine+for+previously+untreated+metastatic+melanoma.">Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).</li><li>Rosenberg, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atezolizumab+in+patients+with+locally+advanced+and+metastatic+urothelial+carcinoma+who+have+progressed+following+treatment+with+platinum-based+chemotherapy:+a+single-arm,+multicentre,+phase+2+trial.">Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial.</a> Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).</li><li>Schadendorf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+Analysis+of+Long-Term+Survival+Data+From+Phase+II+and+Phase+III+Trials+of+Ipilimumab+in+Unresectable+or+Metastatic+Melanoma.">Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).</li><li>Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+PD-L1+positive+or+negative+mean?.">What does PD-L1 positive or negative mean?.</a> J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).</li><li>Rizvi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunology.+Mutational+landscape+determines+sensitivity+to+PD-1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer.">Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Science. 348 (6230), 124-128 (2015).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).</li><li>Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarqueurs+pr&#233;dictifs+de+r&#233;ponse+aux+traitements+bloquant+les+voies+de+costimulation+inhibitrices.">Biomarqueurs pr&#233;dictifs de r&#233;ponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices.</a> Bull Cancer. 103, S151-S159 (2016).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Fourcade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+Tim-3+and+PD-1+expression+is+associated+with+tumor+antigen-specific+CD8++T+cell+dysfunction+in+melanoma+patients.">Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients.</a> J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).</li><li>Koyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+resistance+to+therapeutic+PD-1+blockade+is+associated+with+upregulation+of+alternative+immune+checkpoints.">Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.</a> Nat Commun. 7, 10501 (2016).</li><li>Wherry, E. J., Kurachi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+insights+into+T+cell+exhaustion.">Molecular and cellular insights into T cell exhaustion.</a> Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+represents+dysfunctional+tumor+infiltrating+T+cells+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma.</a> World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).</li><li>Sakuishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tim-3+and+PD-1+pathways+to+reverse+T+cell+exhaustion+and+restore+anti-tumor+immunity.">Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity.</a> J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient's+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges.">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Nizard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+resident+memory+T+cells+enhances+the+efficacy+of+cancer+vaccine.">Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine.</a> Nat Commun. 8, 15221 (2017).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma.">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> Oncoimmunology. (4), (2017).</li><li>Woods, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+in+epitope+specificities+between+IFNgamma+inflamed+and+uninflamed+conditions+leads+to+escape+from+T+lymphocyte+killing+in+melanoma.">Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma.</a> J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1+CD8++T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma.">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma.">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines.">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li><li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8(+)+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors.">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095 (2017).</li></ol>

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.
Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d'onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghe...

Negli ultimi anni, l'immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l'immunoterapia basata sull'inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace1,2,3,4,5, 6. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte cliniche in oltre il 20% dei pazienti7. Tuttavia, non tutti i pazienti sono di intervento, il costo del trattamento è elevato, e questi trattamenti sono tossici, che conduce a potenziali gravi effetti collaterali autoimmune-come. Pertanto, la sfida attuale consiste nell'identificare marcatori predittivi per quelle nuove immunoterapie. Il tasso di mutazioni nel tumore, l'espressione del PD-L1 o i livelli di intratumoral CD8+ infiltrazione delle cellule di T sono stati segnalati per correlare con la risposta clinica. Tuttavia, questa associazione è ancora troppo debole per raccomandare l'uso di questi biomarcatori clinici nella pratica clinica, ad eccezione del test di compagno per PD-L1 prima dell'amministrazione di Pembrolizumab non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC) pazienti8 ,9,1011,12. È stato dimostrato che la co-espressione di molti recettori inibitori come PD-1, Tim-3, Gal-3, e CTLA-4, induce un fenotipo delle cellule di esaurimento e la resistenza alla terapia13,14,15. Poiché il sangue periferico non è rappresentativo del microambiente tumorale, è di grande interesse per analizzare le caratteristiche fenotipiche delle cellule in situ. Cellule di T di co-espressione PD-1 e Tim-3 sono noti per essere cellule funzionalmente alterate in diversi contesti13,16,17. In questo studio, l'impatto prognostico della co-espressione di recettori inibitori due PD-1 e Tim-3 il CD8+ T cellule è stata valutata.
Fino a ora, studiando il co-espressione di marcatori multipli su tumore infiltrante linfociti (TILs) è stata effettuata principalmente dall'analisi di citometria a flusso, rendendo necessario per lavorare su tumori freschi e pertanto senso che osta alla analisi retrospettive. Con la colorazione convenzionale in situ può essere eseguita solo una colorazione in un momento e la caratterizzazione del tipo cellulare che co-esprime i marcatori non è possibile. Ad esempio, PD-L1 è espressa da molti tipi di cellule del microambiente tumorale, che lo rende difficile da definire mediante analisi immunohistochemistry convenzionali quali le cellule che esprimono PD-L1 sono più rilevanti per gli studi correlativi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo innovativo in situ multiparametrica immunofluorescenza con computer-contando per correlare il co-espressione di PD-1 e Tim-3 da tumore infiltrante CD8 T-cellule+ con i risultati clinici in RCC. Questa tecnica ha diversi vantaggi, tra cui la possibilità di analizzare a livello di singola cellula e marcatori multipli allo stesso tempo utilizzando una macchina fotografica multispettrale che può catturare intervalli limitati > 10 nm attraverso cristalli liquidi filtri18. Inoltre, la procedura è automatica e consente una riproducibilità inter-operatore e un'analisi ridotta rispetto alle tecniche manuali19. Nel campo del cancro, parecchi studi riferito convincente stainings multiple di molecole immuni come PD-1, PD-L1 e CD8 nel carcinoma delle cellule di Merkel, cancro ai polmoni e testa e collo cancro20,21,22, 23. il conteggio delle cellule automatizzato è possibile con la formazione da parte dell'utente (passaggio phenotyping). La fluorescenza è misurata nei compartimenti cellulari differenti (nuclei, citoplasma e membrana).
Qui, diversi sottoinsiemi di tumore-infiltrazione CD8+ T cellule esprimenti PD-1 e/o Tim-3 in un'ampia coorte di RCC sono stati contati e i risultati sono stati correlati con punteggi di gravità clinica e parametri di sopravvivenza. È stato anche possibile analizzare l'intensità di fluorescenza della membrana alla risoluzione del cellulare con i dati di intensità di fluorescenza media (MFI) come in citometria. Per quanto ne sappiamo, questo rappresenta i primi risultati prognostici Report Studio utilizzando questa tecnica di conteggio base imaging multispettrale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS142338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm cell analysis 2.1.</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS135781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen delimiting pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin TBS Tablets</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9141Z</td>
			<td>pH7.6 100 tablet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9142Z</td>
			<td>pH 7.6 100 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin blocking system</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0590</td>
			<td>Avidin 0.1% and Biotin 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-001</td>
			<td>5% vol./vol. concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F6057</td>
			<td>1.5 &#181;g/mL concentration&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knittel glass coverslip</td>
			<td>Knittel&#160;Gl&#228;ser,</td>
			<td>100039</td>
			<td>24x60 mm 100 cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD8 Clone P17-V</td>
			<td>novus</td>
			<td>NBP1-79055</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PD-1 Clone NAT</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52587</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Tim-3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2365</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7309457001</td>
			<td>use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11&#160;</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>4528</td>
			<td>use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human gal9&#160;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2045</td>
			<td>use at 0.3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated F(ab&#8217;2) donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-066-150</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150133</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled streptavidin&#160;</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>PA43001</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control mouse IgG1</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from goat serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5256</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from rabbit serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5006</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells

Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l'evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L'analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.
La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell'esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l'immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8+ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.

Mediante il protocollo generale descritto sopra, abbiamo mirato a quantificare intratumoral CD8+ T cellule cheesprimono recettori inibitori PD-1 e Tim-3 nei tessuti congelati da pazienti con RCC e di correlare i risultati con gli esiti clinici25.
Ottimizzazione della colorazione CD8/PD-1/Tim-3:
Diverse specie di antic...

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Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Valutazione della morte cellulare utilizzando un surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidali tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Immunofluorescenza multipla combinata con analisi di immagini spaziali per la valutazione clinica e biologica del microambiente tumorale

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Analisi del flusso a doppio reporter basata su biglie fluorescenti magnetiche del blocco anticorpale indotto dal peptide PDL1-Vaxx dell'interazione PD-1/PD-L1

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...