Name: multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00
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この作品は、Institut 国立デュがん (インカ) (ET)、リーグ contre le がん (ET)、大学ソルボンヌ大学パリ ・ シテ (ET)、ANR (Selectimmunco) (ET)、Labex 免疫腫瘍 (ET)、SIRIC CARPEM (CG, ET) からの助成金によって支えられました。EdG 財団アークの交わりによって資金を供給されました。EV と CD APHP (bourse 極東凝った) の団体によって資金を供給されました。ChB 大学ソルボンヌ大学パリ シテ (契博士) の交わりによって資金を供給します。著者は、このプロジェクトの資金調達のためのブリストル マイヤーズ スクイブをありがとうございます。著者は、病理学の病院位置ジョルジュポンピドーとネッカー (Laurianne シャンボール、エロディ ミシェルとジゼル Legall) の部門をありがとうございます。著者は、PARCC 病院位置ジョルジュ ・ ポンピドゥー (コリーヌ クリスチアーネ) の組織のプラットフォームをありがとうございます。

本研究はヘルシンキ宣言に基づき実施し、ローカル倫理委員会 (CPP イル ・ ド ・ フランス」2012-05-04) によって承認されました。コホートに含まれている参加者からインフォームド コンセントを得た。
1. 組織材料
<ol><li>手術の日に RCC 組織サンプルを収集します。常温 (病理) 手術標本を処理します。</li>
	<li>約 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm サイズ ドライ チューブでの腫瘍のサ?...

<ol>
	<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy:+Rational+and+recent+breakthroughs.">Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs.</a> Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).</li><li>Motzer, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma:+Results+of+a+Randomized+Phase+II+Trial.">Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial.</a> J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+in+previously+untreated+melanoma+without+BRAF+mutation.">Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation.</a> N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipilimumab+plus+dacarbazine+for+previously+untreated+metastatic+melanoma.">Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).</li><li>Rosenberg, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atezolizumab+in+patients+with+locally+advanced+and+metastatic+urothelial+carcinoma+who+have+progressed+following+treatment+with+platinum-based+chemotherapy:+a+single-arm,+multicentre,+phase+2+trial.">Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial.</a> Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).</li><li>Schadendorf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+Analysis+of+Long-Term+Survival+Data+From+Phase+II+and+Phase+III+Trials+of+Ipilimumab+in+Unresectable+or+Metastatic+Melanoma.">Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).</li><li>Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+PD-L1+positive+or+negative+mean?.">What does PD-L1 positive or negative mean?.</a> J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).</li><li>Rizvi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunology.+Mutational+landscape+determines+sensitivity+to+PD-1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer.">Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Science. 348 (6230), 124-128 (2015).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).</li><li>Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarqueurs+pr&#233;dictifs+de+r&#233;ponse+aux+traitements+bloquant+les+voies+de+costimulation+inhibitrices.">Biomarqueurs pr&#233;dictifs de r&#233;ponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices.</a> Bull Cancer. 103, S151-S159 (2016).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Fourcade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+Tim-3+and+PD-1+expression+is+associated+with+tumor+antigen-specific+CD8++T+cell+dysfunction+in+melanoma+patients.">Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients.</a> J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).</li><li>Koyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+resistance+to+therapeutic+PD-1+blockade+is+associated+with+upregulation+of+alternative+immune+checkpoints.">Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.</a> Nat Commun. 7, 10501 (2016).</li><li>Wherry, E. J., Kurachi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+insights+into+T+cell+exhaustion.">Molecular and cellular insights into T cell exhaustion.</a> Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+represents+dysfunctional+tumor+infiltrating+T+cells+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma.</a> World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).</li><li>Sakuishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tim-3+and+PD-1+pathways+to+reverse+T+cell+exhaustion+and+restore+anti-tumor+immunity.">Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity.</a> J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient's+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges.">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Nizard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+resident+memory+T+cells+enhances+the+efficacy+of+cancer+vaccine.">Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine.</a> Nat Commun. 8, 15221 (2017).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma.">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> Oncoimmunology. (4), (2017).</li><li>Woods, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+in+epitope+specificities+between+IFNgamma+inflamed+and+uninflamed+conditions+leads+to+escape+from+T+lymphocyte+killing+in+melanoma.">Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma.</a> J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1+CD8++T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma.">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma.">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines.">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li><li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8(+)+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors.">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095 (2017).</li></ol>

変更とトラブルシューティング:
組織の品質は重要なパラメーターです。ヘマトキシリンとエオシンの着色によって簡単にチェックできます。
技術の利点の 1 つは多重染色の可能性が、fluorophore の波及を避けるためには、発振波長 10 nm 以上のデルタを選択することお勧めします。ここでは、4 染色 DAPI を含むので、我々 は波長を広げて?...

過去数年間の免疫療法は、RCC を含む癌の多くの種類のための非常に有望な治療法として浮上しています。特に、免疫抑制のチェックポイントの阻害に基づく PD 1 のような臨床的に効果的な1,2,3,4,5,報告された ctla の条項 46。 モノクローナル抗体 CTLA-4、いくつかのがんでは既に承認されて PD-1、またはプログラム死配位子 1 (PD L1) と患者7の 20% 以上の長期的な臨床反応をもたらします。それにもかかわらず、ないすべての患者が反応、治療費が高い、これらの治療法は、有毒である、潜在的な深刻な自己免疫性のような副作用に 。したがって、現在の課題は、これらの新しい免疫療法を予測するマーカーを識別するためにです。臨床応答と相関する腫瘍、PD L1 の式または+ T 細胞浸潤 cd8 陽性腫瘍のレベルでの突然変異率を報告されています。しかし、この協会は非小細胞肺癌 (NSCLC) 癌患者8 で Pembrolizumab の管理の前に PD L1 の仲間のテストを除いて臨床実習では臨床マーカーの使用をお勧めしますには弱すぎます。、9,1011,12。PD 1、ティム-3、ラグ-3 のように多くの抑制性受容体の共発現し、CTLA-4 誘導細胞枯渇表現療法13,14,15への抵抗、それは実証されています。末梢血は、腫瘍微小環境の代表ではない、原細胞の表現型の機能の分析に関心の高いのです。PD 1 とティム 3 の共同表現する T 細胞が、いくつかのコンテキスト13,16,17機能的障害の細胞として知られています。この研究で 2 つの抑制性受容体 PD 1 の共発現と CD8 のティム-3 の予後への影響+ T 細胞が評価されました。
腫瘍浸潤リンパ球 (TILs) で複数のマーカーの共発現を勉強して、今までは主に流れフローサイトメトリー解析、新鮮な腫瘍とそのため除外解析上で動作する必要があるサービスによって実行されました。従来その場で染色、一度に 1 つだけの染色を実行できますと共同マーカーを表現するセル型の評価は不可能します。たとえば、PD L1 は、PD L1 を発現する細胞相関研究より関連している従来の免疫組織学的解析による定義を難しく腫瘍微小環境の多くの細胞のタイプによって表されます。今回、我々 は腫瘍浸潤 CD8 PD 1 とティム-3 の共発現を関連付けるコンピューター カウントで革新的なその場で多重蛍光方法を開発+ RCC の臨床結果と T 細胞。このテクニックに制限された間隔をキャプチャすることができますマルチ スペクトル カメラを用いた同時に単一セルのレベルで複数のマーカーを分析する可能性を含むいくつかの利点は、> 10 nm ~ 液晶フィルター18。さらに、プロシージャは自動オペレーター間の再現性とマニュアルのテクニック19に比べて短縮分析ができます。がん分野でいくつかの研究報告、メルケル細胞癌、肺癌、頭頸部癌20,21,22, PD 1、PD L1、cd8 陽性など免疫の分子の複数の染色を説得23. 自動細胞数はユーザー (表現型解析ステップ) による訓練で可能です。蛍光は、別の細胞コンパートメント (核、細胞質と膜) で測定されます。
ここでは、腫瘍浸潤 CD8 の異なるサブセット+ T 細胞表現する PD 1 および/または RCC の大規模コホートでティム 3 は数えられ結果が臨床重力得点と生存率パラメーターと相関しました。また、フローサイトメトリーのような蛍光強度の意味 (MFI) データと携帯電話の解像度で膜の蛍光強度を分析することが可能だった。我々 の知る限り、これは最初の研究レポート予後結果に基づいてカウントするマルチ スペクトル イメージングの技術を使用して表します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS142338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm cell analysis 2.1.</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS135781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen delimiting pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin TBS Tablets</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9141Z</td>
			<td>pH7.6 100 tablet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9142Z</td>
			<td>pH 7.6 100 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin blocking system</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0590</td>
			<td>Avidin 0.1% and Biotin 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-001</td>
			<td>5% vol./vol. concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F6057</td>
			<td>1.5 &#181;g/mL concentration&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knittel glass coverslip</td>
			<td>Knittel&#160;Gl&#228;ser,</td>
			<td>100039</td>
			<td>24x60 mm 100 cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD8 Clone P17-V</td>
			<td>novus</td>
			<td>NBP1-79055</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PD-1 Clone NAT</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52587</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Tim-3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2365</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7309457001</td>
			<td>use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11&#160;</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>4528</td>
			<td>use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human gal9&#160;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2045</td>
			<td>use at 0.3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated F(ab&#8217;2) donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-066-150</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150133</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled streptavidin&#160;</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>PA43001</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control mouse IgG1</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from goat serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5256</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from rabbit serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5006</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells

免疫細胞は腫瘍微小環境の重要なコンポーネントであるし、発癌のすべての段階での腫瘍の成長と進化に影響を与えます。特に、それは今確立してひと腫瘍における免疫の浸潤が予後と治療への反応を関連付けることができます。腫瘍微小環境における免疫の浸潤の解析患者および治療に対する反応の分類の主要な課題となっています。
プログラム細胞死蛋白質 1 (PD1; として知られている CD279)、細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質の 4 (CTLA-4)、T 細胞免疫グロブリン、ムチンを含むタンパク質-3 (ティム 3; として知られている CD366)、リンパ球などの抑制性受容体の共発現アクティブ化の遺伝子 3 (ラグ 3; 別名 CD223) は、T 細胞の枯渇の特徴です。その場で多重蛍光染色、細胞レベルでこれらの抑制性受容体の共発現を定量化することを開発しました。腎細胞癌 (RCC) のフリーズされたティッシュのレトロスペクティブ シリーズでは、画像解析ソフトと相まって蛍光マルチ スペクトル イメージング技術を使用して、腫瘍浸潤 CD8 で PD 1 とティム-3 の共同式が見つかりました+ T 細胞RCC の予後と相関しています。我々 の知る限り、このを表します、この自動多重原・ テクノロジーを示す最初の研究いくつかの臨床的意義があります。

腫瘍 CD8 を定量化する上で説明した一般的なプロトコルを使用して、目的とする患者、RCC と臨床転帰25結果を関連付けることから凍結するティッシュでの PD 1 とティム 3 抑制性受容体の共発現細胞の+ T。
CD8/PD-1/ティム-3 染色の最適化:
抗?...

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Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T 細胞。この再現性と信頼性の高い技術は、大規模コホート解析に適しています。

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

PD-1/PD-L1相互作用のPDL1-Vaxxペプチドワクチン誘導抗体遮断の磁気蛍光ビーズベースのデュアルレポーターフロー分析

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...