Name: multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантов от Института национального du рака (ИНКОВ) (ET), le Лига против рака (ET), Университет Сорбонна Париж Сите (ET), НРУ (Selectimmunco) (ET), Labex иммуно-онкология (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). ЭДГ финансировался стипендий Fondation дуги. EV и CD финансировались братство APHP (биржа année исследований). ChB финансируется стипендий университета Сорбонна Париж Сите (contrat докторской). Авторы благодарят Bristol-Myers Squibb за их финансирование в этом проекте. Авторы благодарят Департамент патологии Hopital Européen Жоржа Помпиду и Некер (Laurianne Шамболь, Элоди Мишель и Жизель ЛЕГАЛЬ). Авторы благодарят гистология платформы PARCC, Hopital Européen Жоржа Помпиду (Corinne Lesaffre).

Это исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларации и был одобрен Комитетом местных этики (CPP Иль де Франс nr. 2012-05-04). Информированное согласие было получено от участника, включены в когортах.
1. ткань материала
<ol><li>Сбор образцов ткани РСС на день опер...

<ol>
	<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy:+Rational+and+recent+breakthroughs.">Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs.</a> Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).</li><li>Motzer, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma:+Results+of+a+Randomized+Phase+II+Trial.">Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial.</a> J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+in+previously+untreated+melanoma+without+BRAF+mutation.">Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation.</a> N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipilimumab+plus+dacarbazine+for+previously+untreated+metastatic+melanoma.">Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).</li><li>Rosenberg, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atezolizumab+in+patients+with+locally+advanced+and+metastatic+urothelial+carcinoma+who+have+progressed+following+treatment+with+platinum-based+chemotherapy:+a+single-arm,+multicentre,+phase+2+trial.">Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial.</a> Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).</li><li>Schadendorf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+Analysis+of+Long-Term+Survival+Data+From+Phase+II+and+Phase+III+Trials+of+Ipilimumab+in+Unresectable+or+Metastatic+Melanoma.">Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).</li><li>Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+PD-L1+positive+or+negative+mean?.">What does PD-L1 positive or negative mean?.</a> J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).</li><li>Rizvi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunology.+Mutational+landscape+determines+sensitivity+to+PD-1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer.">Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Science. 348 (6230), 124-128 (2015).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).</li><li>Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarqueurs+pr&#233;dictifs+de+r&#233;ponse+aux+traitements+bloquant+les+voies+de+costimulation+inhibitrices.">Biomarqueurs pr&#233;dictifs de r&#233;ponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices.</a> Bull Cancer. 103, S151-S159 (2016).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Fourcade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+Tim-3+and+PD-1+expression+is+associated+with+tumor+antigen-specific+CD8++T+cell+dysfunction+in+melanoma+patients.">Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients.</a> J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).</li><li>Koyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+resistance+to+therapeutic+PD-1+blockade+is+associated+with+upregulation+of+alternative+immune+checkpoints.">Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.</a> Nat Commun. 7, 10501 (2016).</li><li>Wherry, E. J., Kurachi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+insights+into+T+cell+exhaustion.">Molecular and cellular insights into T cell exhaustion.</a> Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+represents+dysfunctional+tumor+infiltrating+T+cells+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma.</a> World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).</li><li>Sakuishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tim-3+and+PD-1+pathways+to+reverse+T+cell+exhaustion+and+restore+anti-tumor+immunity.">Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity.</a> J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient's+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges.">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Nizard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+resident+memory+T+cells+enhances+the+efficacy+of+cancer+vaccine.">Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine.</a> Nat Commun. 8, 15221 (2017).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma.">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> Oncoimmunology. (4), (2017).</li><li>Woods, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+in+epitope+specificities+between+IFNgamma+inflamed+and+uninflamed+conditions+leads+to+escape+from+T+lymphocyte+killing+in+melanoma.">Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma.</a> J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1+CD8++T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma.">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma.">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines.">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li><li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8(+)+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors.">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095 (2017).</li></ol>

Модификации и устранения неполадок:
Качество ткани является важным параметром; Он может легко проверяться окраской гематоксилином и эозином.
Одним из преимуществ этого метода является возможность мультиплексных stainings, но чтобы избежать распрос?...

В последние несколько лет иммунотерапия стала весьма перспективным лечения для многих видов рака, включая РСС. В частности иммунотерапия, основанные на ингибирование ингибирующее контрольно-пропускных пунктов, как PD-1 и CTLA-4 было сообщено быть клинически эффективным1,2,3,4,5, 6. моноклональных антител против CTLA-4, PD-1, или программа смерти лигандом 1 (PD-L1) уже утвержденных в несколько рака и привести к длительной клинических ответов в более чем 20% больных7. Тем не менее не все пациенты ответчиков, стоимость лечения является высокой, и эти процедуры являются токсичными, приводит к потенциальные серьезные аутоиммунных как побочные эффекты. Таким образом текущий задача заключается в определении прогнозных маркеров для этих новых immunotherapies. Соотнести с клинической реакции были зарегистрированы темпы мутаций в опухоли, выражение PD-L1 или уровней внутриопухолевых CD8+ Т-клеток инфильтрата. Однако эта Ассоциация еще слишком слаб, чтобы рекомендовать использование этих клинических биомаркеров в клинической практике за исключением компаньона тест для PD-L1 до отправления Pembrolizumab в немелкоклеточного легких рака легкого (НМРЛ) пациентов8 ,9,1011,12. Доказано, что Сопредседатель выражение многих рецепторов ингибирующих как PD-1, Тим-3, ЛАГ-3, и CTLA-4, индуцирует ячейки истощение фенотипа и устойчивость к терапии13,14,15. Так как периферической крови не является представителем микроокружения опухоли, он представляет большой интерес для анализа Фенотипические особенности клеток в situ. PD-1 и Тим-3 совместно выражая Т-клетки известны как функционально нарушениями клеток в нескольких контекстах13,16,17. В это исследование, прогнозные последствия совместного выражение двух рецепторов ингибирующих PD-1 и Тим-3 на CD8+ T оценивалась клетки.
Вверх до сих пор, изучая Сопредседатель выражение несколько маркеров на опухоли, проникнув лимфоцитов (Тилс) главным образом выполнялись cytometry анализ потока, что делает необходимым для работы на свежие опухоли и поэтому исключающие ретроспективный анализ. С обычными в situ окрашивание, только один пятная единовременно может быть выполнена, и характеристика типа клеток, которые совместно выражает маркеры не возможен. Например PD-L1 выражается многие типы клеток микроокружения опухолевых, что делает его трудно определить путем анализа обычных иммуногистохимии, какие ячейки, выражая PD-L1 более актуальны для корреляционного исследования. В этой работе, мы разработали инновационные в situ многопараметрических иммунофлюоресценции метод подсчета компьютер для корреляции со выражение PD-1 и Тим-3 опухоли, проникнув CD8+ Т-клеток с клинические исходы в РКЦ. Этот метод имеет ряд преимуществ, включая возможность для анализа на уровне одной ячейки и несколько маркеров в то же время с помощью многоспектральной камеры, которые могут захватить ограниченным интервалом > 10 Нм через жидкий кристалл фильтры18. Кроме того процедура является автоматической что позволяет воспроизводимость между оператором и сокращенный анализ по сравнению с методами руководства19. В области рака несколько исследований сообщалось, убедить несколько stainings молекул иммунной как PD-1, ПД-L1 и CD8 в Меркель клеточной карциномы, рака легких и головы и шеи рак20,21,22, 23. число автоматизированных ячеек возможна с подготовки пользователем (фенотип шаг). Флюоресценция измеряется в различных клеточных компартментов (ядер, цитоплазмы и мембраны).
Здесь, различные подмножества проникновения опухоли CD8+ T-клеток выражая PD-1 и/или Тим-3 в большой когорты РСС были подсчитаны и результаты коррелировали с параметрами выживания и тяжести клинической оценки. Было также можно анализировать интенсивности флуоресценции мембраны на сотовой резолюции с данными означают интенсивности флуоресценции (MFI) как в цитометрии. Насколько нам известно, это первый отчетности прогнозные результаты исследования с использованием этой многоспектральных изображений на основе фото технике.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS142338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm cell analysis 2.1.</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS135781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen delimiting pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin TBS Tablets</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9141Z</td>
			<td>pH7.6 100 tablet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9142Z</td>
			<td>pH 7.6 100 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin blocking system</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0590</td>
			<td>Avidin 0.1% and Biotin 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-001</td>
			<td>5% vol./vol. concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F6057</td>
			<td>1.5 &#181;g/mL concentration&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knittel glass coverslip</td>
			<td>Knittel&#160;Gl&#228;ser,</td>
			<td>100039</td>
			<td>24x60 mm 100 cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD8 Clone P17-V</td>
			<td>novus</td>
			<td>NBP1-79055</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PD-1 Clone NAT</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52587</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Tim-3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2365</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7309457001</td>
			<td>use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11&#160;</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>4528</td>
			<td>use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human gal9&#160;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2045</td>
			<td>use at 0.3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated F(ab&#8217;2) donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-066-150</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150133</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled streptavidin&#160;</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>PA43001</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control mouse IgG1</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from goat serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5256</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from rabbit serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5006</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells

Иммунные клетки являются важными компонентами микроокружения опухоли и влияние роста опухоли и эволюция на всех стадиях канцерогенеза. В частности теперь хорошо известно, что иммунной проникнуть в человека опухоли можно соотнести с prognosis и ответа на терапию. Анализ иммунной проникнуть в микроокружения опухоли стал серьезной проблемой для классификации пациентов и ответ на лечение.
Совместное выражение рецепторов ингибирующих такие программы клеток смерть белок 1 (PD1; также известен как CD279), цитотоксических Т-лимфоцитов связанные белка (CTLA-4 4), Т-клеток иммуноглобулина и муцина содержащих протеин-3 (Тим-3; также известен как CD366) и лимфоцитов Активации генов 3 (ЛАГ-3; также известен как CD223), является отличительной чертой истощения Т-клеток. Мы разработали многопараметрических в situ иммунофлюоресценции, пятнать для идентификации и количественной оценки на клеточном уровне совместного выражение этих рецепторов ингибирующих. На ретроспективной серии замороженные ткани почечно-клеточной карциномы (РСС), с использованием многоспектральных изображений технологии флуоресценции в сочетании с анализа изображений программное обеспечение, что Сопредседатель выражение PD-1 и Тим-3 было установлено на опухоли, проникнув CD8+ T клетки связан с плохой прогноз в РКЦ. Насколько нам известно, это представляет собой первое исследование демонстрирует, что это Автоматизированная технология мультиплексный в situ могут иметь некоторые клиническое значение.

Использование общего протокола, описанных выше, мы стремились количественно внутриопухолевых CD8+ T клетки совместно выражая ингибирующее рецепторов PD-1 и Тим-3 в замороженных тканях от пациентов с СРК и соотнести результаты с клиническим исходам25.
...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells at JoVE.com

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1+ Тим-3+ CD8 клетки+ T

Изучая микроокружения опухоли может идентифицировать прогностическое или интеллектуального биомаркеров клинической реакции на иммунотерапию. Представленные здесь, инновационный метод основан на в situ флуоресценции многоспектральных изображений для анализа и рассчитывать автоматически различных субпопуляций CD8+ T клетки. Этот воспроизводимый и надежный метод подходит для анализа больших когорты.

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Расширение и обогащение гамма-дельта (γδ) Т-клеток из аферезированного продукта человека

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Мультиплексный анализ изображений штрих-кодирования для иммунопрофилирования и пространственного картирования при одноклеточном анализе образцов парафиновой ткани

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Мультиплексная иммунофлюоресценция в сочетании с анализом пространственных изображений для клинико-биологической оценки микроокружения опухоли

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Анализ магнитного флуоресцентного потока на основе магнитных флуоресцентных шариков блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 пептидным пептидом PDL1-Vaxx

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...