Name: multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells at JoVE.com

Bu eser hibe Institut National du kanser (Inca) (ET), Ligue contre le kanser (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex IMMUNO-Onkoloji (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET) tarafından desteklenmiştir. EdG Fondation ARC Kardeşliği tarafından finanse edildi. EV ve CD APHP (bourse année recherche) Kardeşliği tarafından finanse edilmiştir. Will Université Sorbonne Paris Cité (Kervansaray'a doktora) Kardeşliği tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Bristol Myers Squibb kendi bu projede finansman için teşekkür ederiz. Yazarlar bölümü patoloji nörölojisi Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) teşekkür ederim. Yazar PARCC, nörölojisi Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformunun teşekkür ederiz.

Bu çalışmada Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır ve yerel Etik Komitesi tarafından (CPP Ile de France nr. 2012-05 / 04) kabul edildi. Aydınlatılmış onam olan kohort dahil katılımcıdan elde edildi.
1. doku malzeme
<ol><li>RCC doku örnekleri ameliyat günü toplamak. Oda sıcaklığında (patoloji Bölümü) cerrahi numune baş.</li>
	<li>Yaklaşık 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm boyut kuru bir tüp tümör örnek toplamak. Ek sıvı azot donma ve-80 ° C'de depolayın</li>
...

<ol>
	<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy:+Rational+and+recent+breakthroughs.">Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs.</a> Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).</li><li>Motzer, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma:+Results+of+a+Randomized+Phase+II+Trial.">Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial.</a> J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+in+previously+untreated+melanoma+without+BRAF+mutation.">Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation.</a> N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipilimumab+plus+dacarbazine+for+previously+untreated+metastatic+melanoma.">Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).</li><li>Rosenberg, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atezolizumab+in+patients+with+locally+advanced+and+metastatic+urothelial+carcinoma+who+have+progressed+following+treatment+with+platinum-based+chemotherapy:+a+single-arm,+multicentre,+phase+2+trial.">Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial.</a> Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).</li><li>Schadendorf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+Analysis+of+Long-Term+Survival+Data+From+Phase+II+and+Phase+III+Trials+of+Ipilimumab+in+Unresectable+or+Metastatic+Melanoma.">Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).</li><li>Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+PD-L1+positive+or+negative+mean?.">What does PD-L1 positive or negative mean?.</a> J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).</li><li>Rizvi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunology.+Mutational+landscape+determines+sensitivity+to+PD-1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer.">Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Science. 348 (6230), 124-128 (2015).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).</li><li>Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarqueurs+pr&#233;dictifs+de+r&#233;ponse+aux+traitements+bloquant+les+voies+de+costimulation+inhibitrices.">Biomarqueurs pr&#233;dictifs de r&#233;ponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices.</a> Bull Cancer. 103, S151-S159 (2016).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Fourcade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+Tim-3+and+PD-1+expression+is+associated+with+tumor+antigen-specific+CD8++T+cell+dysfunction+in+melanoma+patients.">Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients.</a> J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).</li><li>Koyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+resistance+to+therapeutic+PD-1+blockade+is+associated+with+upregulation+of+alternative+immune+checkpoints.">Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.</a> Nat Commun. 7, 10501 (2016).</li><li>Wherry, E. J., Kurachi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+insights+into+T+cell+exhaustion.">Molecular and cellular insights into T cell exhaustion.</a> Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+represents+dysfunctional+tumor+infiltrating+T+cells+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma.</a> World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).</li><li>Sakuishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Tim-3+and+PD-1+pathways+to+reverse+T+cell+exhaustion+and+restore+anti-tumor+immunity.">Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity.</a> J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient's+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges.">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Nizard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+resident+memory+T+cells+enhances+the+efficacy+of+cancer+vaccine.">Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine.</a> Nat Commun. 8, 15221 (2017).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma.">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy.">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> Oncoimmunology. (4), (2017).</li><li>Woods, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+in+epitope+specificities+between+IFNgamma+inflamed+and+uninflamed+conditions+leads+to+escape+from+T+lymphocyte+killing+in+melanoma.">Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma.</a> J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1+CD8++T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma.">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma.">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines.">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li><li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8(+)+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors.">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095 (2017).</li></ol>

Değişiklikler ve sorun giderme:
Doku kalitesi önemli bir parametre. kolayca Hematoksilen ve Eozin renklendirme tarafından denetlenebilir.
Çoğaltılmış stainings imkanı teknik bir avantajı vardır, ancak fluorophore yayılma önlemek için emisyon boyları 10 nm asgari delta ile seçmek için öneririz. Çünkü biz 4 stainings DAPI dahil olmak üzere, burada, dalga boylarında yayılan seçtiniz (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, siyanür 3:570...

Son birkaç yıl içinde immünoterapi kanserlerinin RCC dahil olmak üzere, birçok türleri için çok umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, inhibitör denetim noktaları inhibisyonu dayalı immünoterapi gibi PD-1 ve klinik olarak etkili1,2,3,4,5, olmak CTLA-4 bildirilmiştir 6. monoklonal antikorlar karşı CTLA-4, PD-1 veya Program ölüm Ligand 1 (PD-L1) zaten çeşitli kanserler içinde onaylanır ve hastalar%720'den fazla uzun süreli klinik yanıt yol açar. Sonuçta, tüm hastalar cevaplama, tedavi maliyeti yüksektir, ve bu tedaviler potansiyel ciddi otoimmün gibi yan etkileri için önde gelen zehirli. Bu nedenle, geçerli meydan bu yeni immunotherapies için akıllı işaretleri belirlemektir. Tümör, PD-L1 ifade veya intratumoral CD8+ T hücre infiltrasyonu ve düzeyde mutasyonların oranı ile klinik yanıt ilişkilendirmek için bildirilmiştir. Ancak, bu ilişki hala bu klinik biyolojik PD-L1 arkadaşı sınava daha önce küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastaların8 Pembrolizumab yönetiminde dışında klinik pratikte kullanılmasını tavsiye için çok zayıftır ,9,1011,12. PD-1, Tim-3, Lag-3 gibi birçok inhibitör reseptörlerinin ortak ifade ve CTLA-4, indükler bir hücre tükenme fenotip ve terapi13,14,15direnç kanıtlanmıştır. Periferik kan tümör microenvironment temsilcisi olmadığına göre bu hücreleri içinde in situfenotipik özellikleri analiz etmek için yüksek ilgi var. PD-1 ve Tim-3 ortak ifade T hücreleri çeşitli bağlamlarda13,16,17işlevsel olarak Engelli hücrelerde olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, iki inhibitör reseptörler PD-1 ortak ifade ve Tim-3 CD8 prognostik etkisini+ T hücreleri değerlendirildi.
Akış Sitometresi Analizi, taze tümörler ve bu nedenle engelleyen retrospektif analizleri üzerinde çalışmak gerekli olduğunun tarafından ortak ifade birden çok işaretçilerinin tümör infiltre lenfositler (TILs) üzerinde çalışmaya kadar şimdiye kadar esas olarak yapıldı. Geleneksel in situ boyama, tek teker teker boyama gerçekleştirilebilir ve işbirliği işaretleyiciler ifade hücre tipi karakterizasyonu mümkün değildir. Örneğin, PD-L1 PD-L1 ifade hangi hücrelerin Bağdaşık çalışmalar için daha uygun olan geleneksel immünhistokimya analizi tarafından tanımlamak üzere birçok hücre türleri tumoral microenvironment tarafından ifade edilir. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir yenilikçi in situ multiparametric ayirt yöntemi bilgisayar-PD-1 ve Tim-3 ortak ifade CD8 infiltre tümör tarafından ilişkilendirmek için sayma ile+ T-hücreleri RCC klinik sonuçlar ile. Bu teknik bir tek hücre düzeyi ve birden çok işaretçileri sınırlı aralıklarla yakalayabilir bir spektral kamera ile aynı anda analiz imkanı da dahil olmak üzere çeşitli yararları vardır > 10 nm sıvı kristal ile filtreler18. Ayrıca, bu işlem bir arası operatör tekrarlanabilirlik ve el teknikleri19' a göre kısaltılmış bir analiz sağlayan otomatik demek. Kanser alanında çeşitli çalışmalarda Merkel hücreli karsinom, akciğer kanseri ve baş ve boyun kanseri20,21,22, gibi PD-1, PD-L1 ve CD8 bağışıklık moleküllerin birden çok stainings inandırıcı bildirdi 23. otomatik hücre sayısı (fenotipleme adım) kullanıcı tarafından eğitim ile mümkündür. Floresans farklı hücre bölmeleri (nükleuslar, sitoplazma ve membran) ölçülür.
Burada, tümör infiltre-CD8, farklı alt kümelerini+ T hücreleri ifade PD-1 ve/veya Tim-3 RCC büyük bir kohort sayılır ve sonuçları klinik ağırlık puanları ve hayatta kalma parametreleri ile ilişkili. Membran floresan yoğunluğu gibi demek floresan yoğunluğu (MFI) verilerde sitometresi ile hücresel çözünürlükte analiz etmek mümkündü. Bildiğimiz gibi bu bu spektral görüntüleme tabanlı count tekniğin ilk çalışma raporlama prognostik sonuçları kullanarak temsil eder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS142338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm cell analysis 2.1.</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS135781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen delimiting pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin TBS Tablets</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9141Z</td>
			<td>pH7.6 100 tablet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)</td>
			<td>Takara, Bio Inc.</td>
			<td>TAKT9142Z</td>
			<td>pH 7.6 100 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin blocking system</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0590</td>
			<td>Avidin 0.1% and Biotin 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-001</td>
			<td>5% vol./vol. concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F6057</td>
			<td>1.5 &#181;g/mL concentration&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knittel glass coverslip</td>
			<td>Knittel&#160;Gl&#228;ser,</td>
			<td>100039</td>
			<td>24x60 mm 100 cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD8 Clone P17-V</td>
			<td>novus</td>
			<td>NBP1-79055</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PD-1 Clone NAT</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52587</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Tim-3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2365</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7309457001</td>
			<td>use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11&#160;</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>4528</td>
			<td>use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human gal9&#160;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2045</td>
			<td>use at 0.3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated F(ab&#8217;2) donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-066-150</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150133</td>
			<td>use at 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled streptavidin&#160;</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>PA43001</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control mouse IgG1</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931</td>
			<td>use at 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from goat serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5256</td>
			<td>use at 3 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from rabbit serum</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I5006</td>
			<td>use at 4&#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral pd-1+ tim-3+ cd8+ t cells

Bağışıklık hücreleri tümör microenvironment önemli bileşenleridir ve karsinojenezis tüm aşamalarında tümör büyüme ve evrimi etkiler. Özellikle, bu şimdi de insan tümörler bağışıklık infiltrat prognoz ve tedaviye yanıt ile ilişkilendirmek kuruldu. Tümör microenvironment bağışıklık infiltrat analizini hastalar ve tedaviye yanıt sınıflandırılması için büyük bir sorun haline gelmiştir.
İnhibitör reseptörler Program hücre ölüm Protein 1 (PD1; olarak da bilinen CD279), sitotoksik T lenfosit ilişkili Protein 4 (CTLA-4), T-hücre immünglobulin ve müsin içeren Protein-3 (Tim-3; olarak da bilinen CD366) ve lenfosit gibi ortak ifade Harekete geçirmek gen 3 (Lag-3; CD223 olarak da bilinir), T hücre tükenme damgasını olduğunu. Tanımlamak ve hücresel düzeyde Bu inhibitör reseptörler ortak ifade ölçmek için boyama multiparametric in situ ayirt geliştirdik. Renal hücreli karsinom (RCC) dondurulmuş dokusunun retrospektif bir dizi üzerinde bir floresan spektral görüntüleme teknolojisi kullanarak bir görüntü analiz yazılımı ile birleştiğinde, CD8 infiltre tümörle PD-1 ve Tim-3 Co o ifade bulundu+ T hücreleri RCC içinde kötü prognoz ile ilişkilidir. Bu çok katmanlı içinde in situ teknoloji otomatik gösteren ilk çalışma bazı klinik önemi olabilir bizim bilgi için bu temsil eder.

Yukarıda açıklanan genel iletişim kuralını kullanarak, intratumoral CD8 ölçmek amaçlanmıştır+ T hücreleri hastaların RCC ile sonuçları klinik sonuçlar25ile ilişkilendirmek için dondurulmuş dokularda inhibitör reseptörler PD-1 ve Tim-3 ortak ifade.
CD8/PD-1/Tim-3 boyama en iyileştirme:
Antikorlar...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells at JoVE.com

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

PD-1/PD-L1 Etkileşiminin PDL1-Vaxx Peptit Aşısı ile İndüklenen Antikor Blokajının Manyetik Floresan Boncuk Tabanlı Çift Raportörlü Akış Analizi

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...