Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

We zouden graag bedanken Cairn onderzoek voor het werken met ons tot het ontwikkelen van dit systeem, in het bijzonder Mark Henson, Jeremy Graham en Joao Correia. Wij danken ook David Welsh en Akhilesh Reddy voor waardevolle discussie tijdens de ontwerpfase, evenals Peter Laskey (voorheen van Hamamatsu) voor het regelen van de lening van een demo-camera en David Wong voor zijn kritische inbreng in het manuscript.

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro.">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Buhr, D. E., Yoo, S. -. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators.">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li><li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks.">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li><li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling.">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li><li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts.">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li><li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection.">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres, ., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

Geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Het protocol hier beschreven is voor zoogdieren celcultuur, beide onder geperfundeerd en statische omstandigheden. De ALLIGATOR kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere modelsystemen. Inderdaad, het is reeds aangetoond vormen een uitstekend platform voor de gelijktijdige bewaking van motoriek, slaap, en perifere gen expressie ritmes in Drosophila melanogaster gehandhaafd onder constante duisternis15. Ook wordt opgemerkt dat, afhankelijk van de toepassing, camera typen dan die hier genoemd kunnen dienstig zijn. Wij willen dat met de juiste filters, een gewijzigde versie van de huidige setup kan in principe worden gebruikt voor fluorescentie kwantificering.
De enige toepassingen waarvoor de ALLIGATOR niet thuishoren in zijn degenen waarvoor met name hoge ruimtelijke resolutie vereist, zoals beeldvorming van Spatio organisatie van PER2::LUC expressie in organotypic plakjes van de zoogdieren is suprachiasmatic nucleus, of andere kleine weefsel segmenten.
De ALLIGATOR maakt het mogelijk vele experimenten worden uitgevoerd die tot nu toe niet gemakkelijk haalbaar door conventionele technieken hebben. Vergeleken met de huidige methoden voor het meten van bioluminescentie, biedt de ALLIGATOR meer flexibiliteit in zowel het type cel cultuur schotel of dia die kan worden gebruikt, de externe media voorwaarden, gevoeligheid en processivity.
Dit is vooral belangrijk op een moment wanneer er een beweging weg van standaard 2D cel cultuur modellen naar 3D organoid en stroom cultuur systemen. Als zodanig, verwacht wordt dat de ALLIGATOR zorgt voor een flexibele methode waarmee bioluminescentie vele dagen en weken onder een brede waaier van voorwaarden kan worden gemeten.

Het gebruik van luciferases als verslaggevers van genexpressie en eiwit activiteit is uitgegroeid tot een populaire techniek in de moleculaire en cellulaire biologie onderzoek. Dit geldt in het circadiane veld, waar de kinetiek van firefly luciferase synthese en katalytische inactivatie zijn bijzonder geschikt voor het melden van de longitudinale wijzigingen in genexpressie die optreden via de circa 24 h circadiane cyclus. Luciferase is als zodanig werkzaam als een circadiane verslaggever in een breed scala aan organismen, met inbegrip van schimmels, planten, vliegen en zoogdieren1,,2,,3,4.
Wanneer kwantificeren circadiane gen expressie in vitro, wordt een fotomultiplicator (PMT) vaak gebruikt om te registreren de bioluminescente signaal. Bet gebaseerde metingen hebben beperkte flexibiliteit echter meestal beperkt tot een vooraf bepaald formaat bord of schotel. Het is ook niet mogelijk om te verzamelen geen ruimtelijke informatie van monsters gecontroleerd met behulp van een bet, wat tot een verlies van informatie leiden kan wanneer imaging monsters die ruimtelijke variatie in luciferase expressie weergeven. Bovendien, als de bet en de bijbehorende elektronica gevoelig zijn voor storing wanneer blootgesteld aan het bevochtigde milieu van een standaard cel cultuur incubator, met PMTs van de opname van de longitudinale luciferase wordt altijd uitgevoerd in de niet-bevochtigde incubators. Bijgevolg, cel cultuur gerechten moeten worden verzegeld luchtdichte te voorkomen vochtverlies door verdamping en de cultuur-media moet daarom worden gebufferd met 3-(N- morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) of 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), in plaats van de CO-2/bicarbonate systeem dat werkt in vivo en routinematig wordt gebruikt in zoogdieren weefselkweek bufferen.
Als gevolg van deze beperkingen legt meting van bioluminescentie door PMTs meestal strenge beperkingen op de voorwaarden waaronder cellen worden gehandhaafd tijdens experimenten. Om deze problemen te overwinnen, en ook te vergroten van het bereik van mogelijke experimentele omstandigheden, we gebruiken een standaard CO2/n2 170 L weefselkweek incubator dat is aangepast door de toevoeging van een water-gekoeld elektron-vermenigvuldigen Charge - coupled apparaat (EMCCD) camera met anti-nevel optica en digitale controle van temperatuur en gas niveaus. Dit is een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas en Temperature-Optimized Recorder of ALLIGATOR dubbed. De ALLIGATOR zorgt voor aanzienlijk toegenomen flexibiliteit van bioluminescente imaging, zowel voor high-throughput beeldvorming van standaard weefselkweek platen (tot 6 x 96 - of 384-well platen tegelijk) en ook voor niet-standaard weefselkweek systemen, dergelijke Als geperfundeerd cellen gekweekt in microfluidic apparaten. Dit instrument voorziet ook in imaging moet worden uitgevoerd met variabele controle van zowel CO2 en O2 gedeeltelijke druk als temperatuur en bevochtigde voorwaarden.
Het onderstaande protocol beschrijft een methode voor de bioluminescente opname van zoogdiercellen en weefselkweek systemen met behulp van een ALLIGATOR (voortaan 'bioluminescentie incubator' genoemd). Opgemerkt moet worden, maar dat zou het systeem geschikt aan bioluminescente imaging en ook met enige aanpassing, TL beeldvorming, in een aantal andere biologische systemen en contexten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

Luciferase gebaseerde verslaggevers van cellulaire genexpressie zijn op grote schaal gebruikt voor zowel longitudinale en eindpunt testen van biologische activiteit. In de circadiane ritmen onderzoek, bijvoorbeeld geven klok gen fusies met firefly luciferase aanleiding tot robuuste ritmes in cellulaire bioluminescentie die vele dagen aanhouden. Technische beperkingen die verband houden met fotomultiplicator buizen (PMT) of conventionele microscopie gebaseerde methoden voor bioluminescentie kwantificering meestal hebben geëist dat cellen en weefsels worden gehandhaafd onder heel niet-fysiologische omstandigheden tijdens opname, met een trade-off tussen de gevoeligheid en de doorvoer. Hier, rapporteren we een verfijning van de voorafgaande methoden waarmee op lange termijn bioluminescentie imaging met hoge gevoeligheid en doorvoer die steunt een breed scala aan cultuur voorwaarden, met inbegrip van variabele gas en controle van de vochtigheid, en accepteert dat veel verschillende Weefselkweek platen en gerechten. Deze geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) ook kunt de observatie van ruimtelijke variaties in luciferase expressie in een cel enkelgelaagde of weefsel, dat niet gemakkelijk worden waargenomen door traditionele methoden. We benadrukken hoe de ALLIGATOR biedt enorm toegenomen flexibiliteit voor de detectie van luciferase activiteit in vergelijking met bestaande methoden.

Dit artikel schetst een protocol voor de bioluminescente beeldvorming van zoogdiercellen met behulp van een ALLIGATOR (bioluminescentie incubator). Deze techniek zorgt voor flexibiliteit van fysieke installatie en extracellulaire voorwaarden wanneer beeldvormende bioluminescente systemen. Methoden voor zowel de eenvoudige statische weefselkweek (Figuur 1, aanvullende Video 1) en de cultuur van de cel geperfundeerd (Figuur 2, aanvullende Video 2) worden beschreven, maar vele andere opstellingen kunnen worden beeld met behulp van dit systeem. Alle gegevens werden gekwantificeerd aan de hand van de methoden die worden beschreven in sectie 7.
Figuur 1A ziet u een voorbeeld van een opname van 6 x 96-wells-platen met PER2::LUC fibroblasten4bioluminescentie video. De buitenste wells bevatten geen cellen zoals deze niet vereist voor dit experiment waren. Cellen hebben ondergaan differentiële temperatuur entrainment, waarbij ze beide temperatuur cyclus van 12 h, op 32 ° C, gevolgd door 12 h 37 ° C gedurende 72 uur of het omgekeerde (12 h, bij 37 ° C, gevolgd door 12 h, op 32 ° C gedurende 72 uur), ondergaan voordat het wordt gehouden bij constante 37 ° C voor opname. 60 min posities werden genomen elk uur. Twee van deze voorwaarden worden gekwantificeerd in figuur 1B.
Figuur 2A toont een schema van de installatie van een systeem voor weefselkweek geperfundeerd. Dit bestaat uit twee kanaal dia's die zijn verbonden met leidingen. Media wordt gedreven over de cellen door een spuitpomp. De eerste van deze dia's fungeert als een permeabele waterventiel gas (buffer dia) en geen cellen, met de tweede bevat met de cellen waaruit de Bioluminescentie is opgenomen. Een vertegenwoordiger van de opname van de video van dit systeem is afgebeeld in figuur 2B. 15 min posities werden genomen om 15 min. Hier, de cellen worden gehandhaafd onder standaard perfusie voorwaarden of in de aanwezigheid van caseïne kinase inhibitor PF670462, die eerder is aangetoond dat het circadiane periode verlengen en verminderen de amplitude van het klok gen expressie ritmes in gekweekte zoogdiercellen14. Het effect op de PER2::LUC expressie wordt weergegeven in figuur 2C (bovenzijde) tegen cellen behandeld met dezelfde concentratie van de drug onder standaard statische cel kweekomstandigheden weergegeven in figuur 2C (onderste paneel), met kwantificering van de periode weergegeven in figuur 2D. Het is duidelijk uit deze dat behandeling met PF670462 PER2::LUC expressie onder beide sets voorwaarden beïnvloedt. Echter, terwijl cellen behandeld met PF670462 onder geperfundeerd voorwaarden Toon periode verlenging van ongeveer 3 h (3 ±0.9-h), cellen in statische toestand behandeld met het geneesmiddel Toon aanzienlijk grotere periode verlengen tot een periode van &#62; 48 h. Dit kan worden passen door een gedempte cosinus, zoals beschreven in sectie 7, (extra som-van-kwadraten F testen ten opzichte van een rechte lijn, p &#60; 0.0001). Interessant is dat is de omvang van de periode verlengen onder perfusie veel dichter bij die in vivo14waargenomen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Afbeelding 1: voorbeeld van de gegevens. (A) voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed in de Bioluminescentie incubator platen. Putten worden gekwantificeerd zijn gemarkeerd in geel in de aanvullende Video 1. (B) kwantificering van bioluminescentie van A. Twee sets van 3 platen van cellen werden entrained met behulp van temperatuur cycli (12 h, op 32 ° C, 12 h, bij 37° C), die anti-phasic aan elkaar waren te produceren tegenover fasen van PER2 eiwit expressie (n = 6, ± SEM te betekenen). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figuur 2: perfusie met CK1δ remmers. (A) schema van perfusie systeem. (B) voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie onder perfusie cellen. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. (C) kwantificering van bioluminescentie van PER2::LUC fibroblasten onder perfusie en in statische toestand met en zonder 3 µM CK1 inhibitor PF670462 (n = 3, ± SEM te betekenen). Bioluminescentie heeft op minimale en maximale waarden zijn genormaliseerd. (D) analyse van periode (Two-way ANOVA, Holm-Sidak van meerdere vergelijkingen test).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Middellange eindconcentratie (μM)</td>
			<td>Voorraad (mg/mL)</td>
			<td>Voor 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boviene albumine</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalase</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathion</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrine</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>16</td>
			<td>Vloeistof (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Als putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumseleniet</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolzuur</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleenzuur</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liponzuur</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol acetaat</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, alle trans</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-Tocopherol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocoferolacetaat</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: NS21 voorbereiding.
Aanvullende Video 1: voorbeeld video van bioluminescentie uit goed platen. In het volgende voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed platen in de Bioluminescentie incubator. Putten worden gekwantificeerd worden benadrukt in geel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende Video 2: voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie cellen onder perfusie. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

Research

JoVE Journal

Biology

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: Een ImageJ Plugin voor Semi-automatische bladvorm Meting

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...