Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Nous tenons à remercier Cairn recherche pour travailler avec nous pour développer ce système, en particulier Mark Henson, Jeremy Graham et Joao Correia. Nous remercions également David Welsh et Reddy Akhilesh discussion précieuse pendant la phase de conception, ainsi que Peter Laskey (anciennement de Hamamatsu) pour organiser le prêt d’un appareil de démo et David Wong pour son apport critique du manuscrit.

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

Aucun conflit d’intérêt n’existe.

Le protocole décrit ici est pour la culture de cellules de mammifères, aussi bien dans des conditions statiques et perfusées. Toutefois, l’ALLIGATOR peut être facilement adaptée à d’autres systèmes de modèle. En effet, il a déjà été démontré pour fournir une excellente plate-forme pour une surveillance simultanée de locomotion, de sommeil et rythmes d’expression de gène périphériques chez Drosophila melanogaster , maintenus dans l’obscurité totale15. On notera également que, selon l’application, les types d’appareil photo autre que celui mentionné ici peuvent être appropriés. Nous envisageons qu’avec les filtres appropriés, une version modifiée de la configuration actuelle pourrait en principe être utilisée pour la quantification de la fluorescence.
Seules les applications pour lesquelles l’ALLIGATOR pourrait ne pas convenir sont celles pour lesquelles particulièrement haute résolution spatiale est nécessaire, comme l’imagerie d’organisation spatio-temporelle de l’expression PER2::LUC en tranches organotypique des mammifères noyau suprachiasmatique, ou autres petites tranches.
L’ALLIGATOR permet de nombreuses expériences à réaliser qui jusqu’ici n’ont pas été facile du faire par des techniques d’enregistrement classiques. Par rapport aux méthodes actuelles de mesure de la bioluminescence, l’ALLIGATOR fournit une plus grande souplesse à la fois le type de boîte de Petri de cellule ou diapositive qui peut être utilisé, les conditions du milieu externe, sensibilité et processivité.
Cela est particulièrement vrai à la fois lorsqu’il y a un éloignement des modèles de culture cellulaire 2D standard vers des systèmes de culture organoïde et flux 3D. Par conséquent, il est prévu que l’ALLIGATOR fournira une méthode adaptable par laquelle, bioluminescence peut être mesurée pendant plusieurs jours et des semaines sous un large éventail de conditions.

L’utilisation de luciférases comme reporters de l’expression génique et l’activité de la protéine est devenue une technique populaire en recherche en biologie moléculaire et cellulaire. Cela est vrai dans le domaine circadien, où la cinétique de la synthèse de luciférase firefly et inactivation catalytique sont particulièrement bien adaptés pour avoir signalé les changements longitudinaux dans l’expression des gènes qui se produisent pendant environ 24 h cycle circadien. Par conséquent, luciférase travaille comme journaliste circadienne dans un large éventail d’organismes, y compris les champignons, les plantes, les mouches et les mammifères1,2,3,4.
Lors de la quantification circadienne gene expression in vitro, un tube photomultiplicateur (PMT) est couramment utilisé pour enregistrer le signal de bioluminescent. Mesures PMT ont peu de flexibilité cependant, habituellement étant limité à une taille prédéterminée d’assiette ou un plat. Il n’est également pas possible de recueillir toute information spatiale des échantillons contrôlés à l’aide d’un PMT, qui peut conduire à une perte d’information lors de l’imagerie des exemples qui montrent la variation spatiale dans l’expression de la luciférase. En outre, comme le PMT et électroniques associés ont tendance à mal fonctionner lorsqu’il est exposé à l’environnement humidifié d’un incubateur de culture cellulaire standard, enregistrement de luciférase longitudinales à l’aide de PMT est toujours effectuée dans des incubateurs non humidifié. En conséquence, les récipients de culture cellulaire doivent être scellés hermétiquement pour empêcher la perte d’humidité par évaporation et les milieux de culture doit donc être mis en mémoire tampon avec 3 - sulfonique (N- morpholino) (MOPS) ou 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES), plutôt que le CO2/bicarbonate mise en mémoire tampon de système qui fonctionne en vivo et est utilisé couramment en culture de tissus chez les mammifères.
En raison de ces limitations, mesure de la bioluminescence par PMTs met généralement des restrictions sévères sur les conditions dans lesquelles les cellules sont maintenues au cours d’expériences. Pour surmonter ces problèmes et aussi pour augmenter la portée des conditions expérimentales possibles, nous utilisons un standard CO2/N2 170 L vitroplants incubateur qui a été adapté par l’ajout d’un eau réfrigérée électron-multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD) appareil photo avec optique anti-buée et contrôle numérique des niveaux de température et de gaz. Il a été surnommé un automatique longitudinale luciférase Imaging gaz et Temperature-Optimized enregistreur ou ALLIGATOR. L’ALLIGATOR permet une flexibilité une augmentation substantielle de bioluminescent imaging, tant pour l’imagerie des plaques de culture de tissus standard haut-débit (jusqu'à 6 x 96 ou 384 puits plaques en même temps) et aussi pour les systèmes de culture de tissus non standard, ces comme les cellules perfusés en Dispositifs microfluidiques. Cet instrument permet également d’imagerie pour se produire dans des conditions humidifiées et avec contrôle variable de CO2 et O2 partielle pression tant que la température.
Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour l’enregistrement bioluminescente de cellules de mammifères et de systèmes de culture de tissus à l’aide d’un ALLIGATOR (ci-après dénommé « incubateur de bioluminescence »). Toutefois, il est à noter que le système serait bien adapté à l’imagerie bioluminescente et aussi, avec quelques modifications, imagerie, dans un certain nombre d’autres systèmes biologiques et des contextes fluorescente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

Axée sur la luciférase reporters de l’expression génique cellulaire sont largement utilisées depuis longitudinales et des analyses de point d’arrêt de l’activité biologique. Dans la recherche de rythmes circadiens, par exemple, fusions de gènes d’horloge avec luciférase firefly donnent lieu aux rythmes robustes bioluminescence cellulaire qui persistent pendant plusieurs jours. Limitations techniques associées aux tubes photomultiplicateurs (PMT) ou des méthodes classiques axées sur la microscopie pour la quantification de la bioluminescence ont généralement exigé que les cellules et les tissus soit maintenu dans des conditions tout à fait non physiologiques au cours de enregistrement, avec un compromis entre sensibilité et le débit. Nous rapportons ici un raffinement des méthodes antérieures qui permet à long terme d’imagerie de bioluminescence haute sensibilité et un débit qui prend en charge un large éventail de conditions de culture, y compris les gaz variable et régulateur d’humidité, et qui accepte plusieurs différents plaques de culture de tissus et de plats. Cette luciférase longitudinale automatisé imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) également permet l’observation des variations spatiales dans l’expression de la luciférase à travers une monocouche de cellules ou de tissus, qui ne peuvent être facilement observés par traditionnel Méthodes. Nous mettons en évidence comment l’ALLIGATOR fournit beaucoup plus de flexibilité pour la détection de l’activité de la luciférase en comparaison avec les méthodes existantes.

Cet article décrit un protocole pour l’imagerie bioluminescente de cellules de mammifères à l’aide d’un ALLIGATOR (incubateur de bioluminescence). Cette technique donne une flexibilité de configuration physique et conditions extracellulaires bioluminescentes systèmes d’imagerie. Méthodes pour simple culture de tissus statique (Figure 1, supplémentaire vidéo 1) et culture de cellules perfusé (Figure 2, supplémentaires vidéo 2) sont décrits, mais de nombreuses autres configurations pourraient être photographiées à l’aide de ce système. Toutes les données ont été quantifiées en utilisant les méthodes décrites dans la Section 7.
Figure 1 a montre un exemple de vidéo d’une bioluminescence enregistrement à partir de plaques 6 x 96 puits contenant de fibroblastes PER2::LUC4. Les puits ultrapériphériques ne contiennent pas de cellules car elles n’étaient pas requis pour cette expérience. Les cellules ont subi l’entraînement différentiel de température, par lequel ils subissent un cycle de température de 12 h, à 32 ° C, suivie à 12 h 37 ° C pendant 72 h ou l’inverse (12 h, à 37 ° C, suivie à 12 h, à 32 ° C pendant 72 h), avant se tient à la constante de 37 ° C pour l’enregistrement. 60 min expositions étaient prises toutes les heures. Deux de ces conditions sont quantifiés dans la Figure 1 b.
Figure 2 a montre une représentation schématique de l’installation d’un système de culture de tissus perfusé. Il s’agit de deux diapositives canal connectés avec la tuyauterie. Media est conduit à travers les cellules par un pousse-seringue. Le premier de ces diapositives agit comme un barboteur perméable de gaz (diapositive tampon) et ne contient aucune cellule, avec le second contenant les cellules d'où la bioluminescence est enregistré. Un représentant d’enregistrement vidéo de ce système est illustré à la Figure 2 b. 15 min expositions étaient prises toutes les 15 min. Ici, les cellules sont maintenues dans des conditions standard de perfusion ou en présence de l’inhibiteur de la kinase caséine PF670462, qui a déjà été démontré que rallonger la période circadienne et réduire l’amplitude des horloge gene expression rythmes en élevage les cellules de mammifères,14. L’effet sur l’expression PER2::LUC est illustré dans la Figure 2 (panneau supérieur) contre les cellules traitées avec la même concentration de médicament dans les conditions de culture de cellules statiques standard illustré à la Figure 2 (panneau inférieur), avec la quantification de la période illustré à la Figure 2D. Il ressort clairement de ce que le traitement avec PF670462 influence PER2::LUC expression sous les deux ensembles de conditions. Cependant, tandis que les cellules traitées avec PF670462 sous conditions perfusées Voir la période allongement d’environ 3 h (3 h de ±0.9), des cellules dans des conditions statiques, traitées avec le médicament montrent un allongement période nettement supérieur à une période de &#62; 48 h. Ceci peut être adapté par un cosinus amorti, tel que décrit dans la Section 7, (F extra-somme des carrés d’essai par rapport à une ligne droite, p &#60; 0,0001). Fait intéressant, l’ampleur de l’allongement période sous perfusion est beaucoup plus proche de celle observée in vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : exemple de données. (A) exemple de capture vidéo de la bioluminescence de PER2::LUC immortalisées dans 6 x 96 plaques bien dans l’incubateur de bioluminescence. Puits à quantifier ont été surlignés en jaune dans le supplémentaire vidéo 1. (B) Quantification de la bioluminescence chez A. Deux ensembles de 3 plaques de cellules ont été entraînés à l’aide des cycles de température (12 h, à 32 ° C ; 12 h, à 37° C) qui étaient anti-phasiques mutuellement pour produire en face des phases d’expression de protéine PER2 (n = 6, moyenne ± et). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figure 2 : Perfusion avec inhibiteurs de la CK1δ. (A) Représentation schématique du système de perfusion. (B) exemple de vidéo instantané d’une bioluminescence enregistrement de PER2::LUC cellules sous perfusion. Une zone de prélèvement de quantification est surlignée en jaune. (C) Quantification de la bioluminescence des fibroblastes PER2::LUC sous perfusion et dans des conditions statiques avec ou sans inhibiteur de CK1 µM 3 PF670462 (n = 3, moyenne ± et). Bioluminescence a été normalisée aux valeurs minimales et maximales. (D) l’analyse de la période (Two-Way ANOVA, test de comparaisons multiples de Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Concentration moyenne finale (μM)</td>
			<td>Stock (mg/mL)</td>
			<td>Pour 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumine bovine</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathion</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline</td>
			<td>0,6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxyde dismutase</td>
			<td>0,077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrine</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0,0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Éthanolamine</td>
			<td>16</td>
			<td>Liquide (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sélénite de sodium</td>
			<td>0,083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticostérone</td>
			<td>0,058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide linoléique</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide linolénique</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide lipoïque</td>
			<td>0,2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progestérone</td>
			<td>0,02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acétate de rétinol</td>
			<td>0,2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rétinol, toutes les trans</td>
			<td>0,3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocophérol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocophérol</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : NS21 préparation.
Supplémentaire 1 vidéo : vidéo d’exemple de la bioluminescence de plats. Exemple vidéo instantané de bioluminescence de PER2::LUC immortalisée en plaques bien 6 x 96 dans l’incubateur de bioluminescence. Puits à doser sont surlignés en jaune. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaire 2 vidéo : capture vidéo exemple d’une bioluminescence enregistrement de PER2::LUC cellules sous perfusion. Une zone de prélèvement de quantification est surlignée en jaune. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

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