Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

我々 は特にマーク ・ ヘンソン、ジェレミー ・ グラハムとジョアン ・ コレイア、このシステムの開発に協力してくださった、ケアン研究を感謝したいです。我々 もありがとうデイヴィッド ウェールズ語とアクヒレシュ ・ レディ (旧浜松市) のピーター ・ ラスキーと同様、設計段階の間に貴重な議論のための原稿に彼の重要な入力デモ カメラとデビッド ・ ウォンのローンの手配します。

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro.">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Buhr, D. E., Yoo, S. -. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators.">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li><li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks.">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li><li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling.">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li><li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts.">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li><li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection.">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres, ., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

利益相反は存在しません。

ここで説明されているプロトコルは、哺乳類細胞培養、灌流および静的な条件の下で両方のです。しかし、ワニは簡単に他のモデル システムに適応できます。確かに、それが運動、睡眠とキイロショウジョウバエ暗黒15.の下で維持される周辺遺伝子発現リズムの同時監視するための優れたプラットフォームを提供するために示されて既にいます。ここに記載されている以外のカメラの種類のアプリケーションによっては、適切にする可能性がありますをまた指摘しました。我々 は、適切なフィルターで変更されたバージョンの現在のセットアップされる可能性がありますプリンシパルの蛍光定量を想定します。
ワニできない可能性があります適切な唯一のアプリケーションは、特に高空間分解能は、哺乳類の脊髄スライスにおける PER2::LUC 発現の時空間組織のイメージングなど、必要です視交叉上核やその他の小さな切片。
ワニは、これまでの従来の録音技術によって容易に達成されていない実行する多くの実験できます。生物発光の測定に対する現在の方法と比べると、ワニは、細胞培養ディッシュまたは使用できるスライド、外部メディア条件、感度、およびドメインの両方のタイプの柔軟性の向上を提供します。
これは特に関連して同時に 3 D organoid 文化システムに向けて標準的な 2次元細胞モデルから移動がある場合。など、ワニが多くの幾日および週の条件の広い範囲の下に、生物発光を測定できます適応メソッドを提供すると予想されます。

ルシフェラーゼ遺伝子の発現と蛋白質の活動の記者としての分子細胞生物学研究の一般的な手法となっています。これはホタルのルシフェラーゼの合成と触媒不活性化の速度が約 24 h の概日サイクルにわたって発生する遺伝子発現の変化をレポートに特に適して概において当てはまります。など、ルシフェラーゼは有機体、菌類、植物、ハエ、哺乳類1,2,3、4などの広い範囲にわたって概記者として採用されています。
概日遺伝子発現の in vitroの定量化、光電子増倍管 (PMT) は発光信号を記録する通常使用されます。光電子増倍管を用いた測定柔軟性が限られてしかし、通常、あらかじめ決められた版か皿サイズに制限されています。じゃはまたイメージングのルシフェラーゼ発現のばらつきを示すサンプル情報の損失につながることができる光電子増倍管を使用して監視のサンプルから空間情報を収集することが可能ではないです。また、光電子増倍管と関連する電子工学標準細胞文化のインキュベーターの加湿環境にさらされたときに誤動作しやすいが、光電子増倍管を用いた縦ルシフェラーゼ記録は非加湿インキュベーターで常に実行されます。その結果、細胞培養皿の気密性の高い蒸発による水分の損失を防ぐために密封されなければならないし、文化メディアは 3-したがってバッファーする必要があります (Nmorpholino) propanesulfonic 酸 (モップ) または 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) ではなく、生体内で機能し、哺乳類の組織培養で日常的に使用されているシステムをバッファリング CO2/bicarbonate。
これらの制限の結果として光電子増倍管による生物発光の測定は通常細胞、実験間は保持される条件に制約を配置します。我々 が、標準的な CO2/N2 170 L 培養インキュベーター、水・低温電子-乗算の添加により適応したを使用してこれらの問題を克服するために、また可能な実験条件の範囲を拡大するには曇らない光学およびデジタル制御温度やガスの電荷結合素子 (EMCCD) カメラ。これは縦ルシフェラーゼ イメージング ガスの自動化や Temperature-Optimized レコーダー、ワニと呼ばれています。ワニ生物発光イメージング、両方標準的な組織培養プレートの高速イメージングのための大幅に高められた柔軟性を可能 (最大 6 x 96 または 384-ウェル プレート同時に) およびまた標準培養システム、そのような灌流セルとしてマイクロ流体デバイスで栽培。この楽器も両方 CO2 O2分圧と温度可変制御と加湿条件下で発生するイメージングできます。
以下のプロトコルでは、哺乳類の細胞の培養システム (今後 '発光インキュベーター' というワニを使用して発光記録する方法について説明します。しかし、システム生物発光イメージング、また、いくつかの変更は、他の生物学的システムとコンテキストの数でのイメージングに適してこと、注意すべきであります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

細胞の遺伝子発現のレポーターをルシフェラーゼ ベースは、縦方向の両方の広範な使用とエンドポイントを生物学的活性の試金。概日リズム研究のたとえば、ホタルのルシフェラーゼと時計遺伝子の融合を生じさせる堅牢なリズムで数日間保持細胞生物発光。技術的な制限は、光電子増倍管 (PMT) に関連付けられているまたは発光定量化のため従来の顕微鏡ベースの方法は通常の間にかなり非生理的条件下で細胞や組織が維持されることを要求しています。感度とスループットのトレードオフで録音。ここで、異なる高感度可変ガス ・湿度制御を含む培養条件の広い範囲をサポートする、受け入れる多くのスループットと長期的な生物発光イメージングを可能にする従来の方法の改良を報告します。組織培養プレートと料理。またガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージングこの自動縦ルシフェラーゼ単層細胞またはティッシュ、従来容易に観察することはできません間ルシフェラーゼ発現の空間変動の観測が可能します。メソッド。我々 はワニがルシフェラーゼ活性既存手法と比較した場合の検出の非常に高い柔軟性を実現する方法を強調表示します。

この記事では、生物発光イメージング ワニ (発光インキュベーター) を使用して哺乳類セルのためのプロトコルについて説明します。この手法により物理的なセットアップおよび細胞外の条件の柔軟生物発光システムをイメージングするとき。単純な静的培養 (図 1、補助ビデオ 1) と灌流培養 (図 2、附則のビデオ 2) の両方の方法を説明しますがこのシステムを使用して他の多くのセットアップを描出できた。すべてのデータは、セクション 7 に記載されている方法を使用して定量化されました。
図 1 aは、生物発光 PER2::LUC 線維芽細胞4を含む 6 x 96 ウェルのプレートからの録音のビデオの例を示します。最も外側の井戸は、細胞を含まない、これらがこの実験のために必要ではなかった。セル録音のため一定の 37 ° C で開催されている前に後 12 h 72 h または (12 h、12 h、72 h 32 ° C で続いて 37 ° c)、コンバースの 37 ° C に 32 ° c、12 時間のいずれかの温度サイクルを受けるという温度差同調してきました。 60 分エクスポー ジャーは、すべての時間を撮影されました。これらの条件の 2 つが図 1 bで定量化しました。
図 2 aは、灌流培養システムのセットアップの概略を示しています。これは、チューブで接続されている 2 つのチャネルのスライドで構成されています。メディアは、シリンジ ポンプによってセルを介して駆動されます。これらのスライドの最初のガス透過性バブル トラップ (バッファー スライド) として機能し、2 番目のセルが含まれていない生物発光の記録から細胞を含みます。このシステムからビデオを録画代表を図 2 bに示します。15 分のエクスポー ジャーは、15 分毎に撮影されました。標準灌流条件下またはカゼインのキナーゼ阻害剤を概日周期を長くして、培養における時計遺伝子発現リズムの振幅を低減以前示されている PF670462 の存在下での細胞の維持、ここで哺乳類セル14。PER2::LUC 発現に及ぼす影響は期間の定量化 (底板)、図 2に示す標準的な静的な細胞培養条件下での薬物の濃度が同じ細胞に対して図 2 (最上位のパネル) に示すように図 2 Dで表示されます。PF670462 による治療条件の両方のセットの下で PER2::LUC 式に影響を与えることこれから明らかです。ただし、灌流条件のショー期間延長約 3 h (3 発熱量 h) の下で PF670462 で処理した細胞、間薬剤と扱われる静的な条件のセル表示の期間により大幅に期間延長 &#62; 48 h。これは、減衰のコサインが第 7 節で説明するように適合 (余分な二乗和 F テスト対直線 p &#60; 0.0001)。興味深いことに、灌流の下で期間延長の大きさは、生体内で14を観察にかなり近いです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
図 1: データの例です。6 x 96 で不死化 PER2::LUC の生物発光のビデオ スナップ ショットはよく発光インキュベーターのプレート (A) の例。定量化する井戸は、附則のビデオ 1で黄色で強調されています。(B) A からの発光の定量化逆 PER2 タンパク質発現相を生成する互いに反一過性だった温度サイクル (12 h は、32 ° c; 12 h、37 ° C で) を使用してセルの 3 プレートの 2 セットが噴流床 (n = 6, ± SEM を意味する)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
図 2: CK1δ 阻害剤による血液灌流します。(A) 灌流システムの模式図。(B) 例 PER2::LUC から記録生物発光のビデオ スナップ ショットの灌流下のセルします。定量化のサンプル領域が黄色で強調表示されます。(C) PER2::LUC 線維芽細胞灌流の下で、3 μ M CK1 阻害剤 PF670462 と静的条件下での発光の定量化 (n = 3、± SEM を意味する)。生物発光は、最小値と最大値に正規化されています。期間 (双方向分散分析, ホルム Sidak の多重比較検定) の (D) 分析。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>最終的な中濃度 (μ M)</td>
			<td>株式 (mg/mL)</td>
			<td>400 mL NS21 の</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛のアルブミン</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>カタラーゼ</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グルタチオン</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>インスリン</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スーパーオキシドジスムターゼ</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ホロ トランスフェリン</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo L サイロニン)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L カルニチン</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エタノールアミン</td>
			<td>16</td>
			<td>液体 (1 g/ml)</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-ガラクトース</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>プトレシン</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亜セレン酸ナトリウム</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 Μ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コルチコステロン</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リノール酸</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リノレン酸</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リポ酸</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>プロゲステロン</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0.04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>レチノール アセテート</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>レチノール、すべてトランス</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D、L-α-トコフェ ロール</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D、L-α-トコフェ ロール酢酸</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: NS21 準備。
補助ビデオ 1: ウェル プレートの生物発光例ビデオ。生物発光のインキュベーターで 6 x 96 ウェル プレートで不死化 PER2::LUC の生物発光例ビデオ スナップ ショット。定量化する井戸は、黄色で強調表示されます。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補助ビデオ 2: PER2::LUC から記録生物発光の例ビデオ スナップ ショットの灌流下のセルします。定量化のサンプル領域が黄色で強調表示されます。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを使用できます、条件の広い範囲の下で発光細胞から長手記録です。ワニ、概日リズム研究のコンテキストで使用される方法を紹介します。

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

Research

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Biology

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