Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

우리는 케 른 연구 특히 마크 헨 슨, 제레미 그레이엄과 호 코 레이 아에서에서이 시스템을 개발 하기 위해 우리와 함께 작업 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 감사 데이비드 웨일스어 및 Akhilesh 레디 (하 마)의 이전 피터 Laskey 뿐 아니라 설계 단계 동안 귀중 한 토론에 대 한 원고를 그의 중요 한 입력에 대 한 데모 카메라와 데이비드 웡의 대출을 정리.

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro.">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Buhr, D. E., Yoo, S. -. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators.">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li><li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks.">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li><li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling.">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li><li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts.">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li><li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection.">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres, ., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

아니 이해 충돌 존재 한다.

여기에 설명 된 프로토콜 끼얹는다 고 정적 조건 모두 포유류 세포 배양입니다. 그러나, 악어 쉽게 다른 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 실제로, 그것은 이미 표시 되었습니다 동시 운동, 수 면, 그리고 주변 유전자 초파리 melanogaster 상수 어둠15. 유지에 식 리듬의 모니터링을 위한 뛰어난 플랫폼을 제공 하 그것은 또한 응용 프로그램에 따라 여기에 언급 된 그 외 카메라 유형을 적절 한 있을 수 있습니다, 지적 했다. 우리는 적절 한 필터와 함께 현재 설치의 수정된 된 버전 보안 주체에 사용 될 수 형광 정량화 정시.
악어 적절 한 않을 수 있습니다 유일한 응용 프로그램은 특히 높은 공간 해상도 필요할는 포유류의 organotypic 조각에 PER2::LUC 식의 spatiotemporal 조직의 이미징 suprachiasmatic 핵, 또는 다른 작은 조직 조각입니다.
악어는 지금 까지는 되지 않은 기존의 레코딩 기술에 의해 쉽게 달성 많은 실험을을 수행할 수 있습니다. 생물 발광의 측정을 위한 현재 방법과 비교해, 악어 셀 문화 접시 또는 사용할 수 있는 슬라이드, 외부 미디어 조건, 감도, 및 processivity 두 유형의 증가 유연성을 제공 합니다.
이것은 특히 적합 한 번에 3D organoid 문화 시스템이 향해 문화 모델은 표준 2D 셀에서 이동이 있을 때. 이와 같이, 악어는 생물 발광은 많은 일 및 광범위 한 조건 아래 주에 측정 될 수 있다 적응 방법을 제공할 것입니다 예상 된다.

유전자 발현 및 단백질 활동의 기자로 luciferases 사용 하 여 분자 및 세포 생물학 연구에서 인기 있는 기술 되고있다. 이것은 사실이 circadian 필드, 반딧불 luciferase 합성 및 촉매 비활성화의 속도 약 24 h circadian 주기 동안 발생 하는 유전자 발현의 경도 변화를 보고 하는 데 특히 적합. 이와 같이, luciferase 생물, 균 류, 식물, 파리, 그리고 포유류1,2,,34를 포함 하 여의 넓은 범위에 걸쳐 circadian 기자로 채택 된다.
Circadian 유전자 식에 체 외에서측정 될 때 광 전 증폭 관 관 (PMT) 발광 신호를 기록 하는 데 주로 사용 됩니다. 그러나 PMT 기반 측정 제한 유연성, 일반적으로 미리 정해진된 접시 또는 접시 크기에 제한 되 고. 그것은 불가능도 luciferase 식에서 공간 변화를 보여 주는 샘플을 이미징 하는 경우 정보의 손실에 지도할 수 있는 PMT를 사용 하 여 모니터링 샘플에서 공간 정보를 수집 합니다. 또한, PMT와 관련된 전자는 표준 셀 문화 인큐베이터의 습도 환경에 노출 되 면 오작동 하는 경향이, Pmt를 사용 하 여 경도 luciferase 녹음은 항상 비 습도 인큐베이터에서 수행 됩니다. 결과, 셀 문화 요리 공기 증발을 통해 수 분 손실을 방지 하기 위해 꽉 밀봉 해야 합니다 및 3-따라서 문화 미디어를 버퍼링 해야 합니다 (N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 또는 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), vivo 기능 그리고 포유류 조직 문화에서 일상적으로 사용 하는 시스템을 버퍼링 CO2/bicarbonate 보다는.
이러한 제한의 결과로 Pmt에 의해 생물 발광의 측정은 일반적으로 세포 실험 동안 유지 되는 조건에 꽉 제한을 장소. 이러한 문제를 극복 하 고 또한 가능한 실험 조건의 범위를 증가, 우리는 표준 공동2/N2 170 L 조직 문화 인큐베이터는 물 냉장 전자-멀티의 추가 의해 적응 되었습니다 사용 하 여 전 하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 anti-mist 광학 및 디지털 제어 온도 가스 레벨의. 이 가스 이미징 Luciferase 자동 경도 및 Temperature-Optimized 레코더, 또는 악어 별명은. 악어 발광 이미징, 모두 표준 조직 배양 플레이트의 높은 처리량 이미징의 유연성을 크게 증가 수 있습니다 (동시에 최대 6 x 96-또는 384-잘 접시)와 또한 비표준 조직 문화 시스템에 대 한 이러한 끼얹는다 셀으로 미세 장치에서 성장. 이 악기는 또한 가변 제어 모두 CO2 와 O2 부분 압력으로 온도 습도 조건 하에서 발생 하는 화상 진 찰에 대 한 수 있습니다.
프로토콜 아래 포유류 세포와 악어 (이제부터 '생물 발광 인큐베이터' 라고도 함)를 사용 하 여 조직 문화 시스템의 발광 녹음 하는 방법을 설명 합니다. 그러나 그것은,, 시스템 발광 영상 하 고 또한, 일부 수정, 형광 이미징, 다른 생물 학적 시스템 및 컨텍스트 수에 적합 될 것 이라고 주목 한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

세포 유전자 발현의 기자 luciferase 기반 둘 다 경도 대 한 광범위 한 사용에 있고 끝점 생물 학적 활동의 분석 실험. Circadian 리듬 연구, 예를 들어 반딧불 luciferase와 시계 유전자 융해 일으키 강력한 리듬에 많은 일 동안 유지 세포 생물 발광. 광 전 증폭 관 관 (PMT)와 관련 된 기술 제한 또는 생물 발광 정량화에 대 한 기존의 현미경-기반 방법 일반적으로 세포와 조직 중 아주 비 생리 적 조건 하에서 유지 될 요구 했다 녹음, 감도 처리량 사이 교환. 여기, 우리 수 있도록 장기적인 생물 발광 영상 높은 감도와 처리량을 문화 조건, 습도 제어, 가변 가스 등의 광범위 한 범위를 지원 하 고 많은 종류를 원하는 다른 이전 방법의 상세 보고 조직 문화 접시 그리고 요리입니다. 또한 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징이 자동화 경도 luciferase 셀 단층 또는 전통에 의해 쉽게 관찰 될 수 없습니다. 있는 조직, luciferase 식 공간 변이의 관측 수 방법입니다. 우리는 악어 기존의 방법에 비해 luciferase 활동의 탐지에 대 한 대폭 증가 유연성을 제공 하는 방법을 강조 표시 합니다.

이 문서는 악어 (생물 발광 인큐베이터)를 사용 하 여 포유류 세포의 발광 영상에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 발광 시스템 이미징 extracellular 조건과 실제 설치의 유연성에 대 한 수 있습니다. 간단한 정적 조직 문화 (그림 1, 보조 비디오 1) 및 (그림 2, 보조 비디오 2) 끼얹는다 세포 배양 방법을 설명 하지만 다른 많은 설정을이 시스템을 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 모든 데이터 섹션 7에 설명 된 방법을 사용 하 여 정량 했다.
그림 1A PER2::LUC fibroblasts4를 포함 하는 6 x 96 잘 접시에서 녹음 하는 생물 발광의 비디오는 예를 보여 줍니다. 이들은이 실험에 필요한으로 바깥쪽 웰 스 셀을 포함 하지 않습니다. 녹음에 대 한 지속적인 37 ° C에서 개최 되 고 전에 셀 차동 온도 유입, 그것에 의하여 그들은 32 ° C 12 h 72 h 또는 대화 (12 h, 12 h 72 h에 32 ° C에 뒤 37 ° C에서), 37 ° C에 의해 다음에 12 h의 어느 온도 사이클을 받게 받은 합니다. 60 분 노출 매 시간을 촬영 했다. 이러한 조건 중 두 개는 그림 1B에서 정량.
그림 2A 끼얹는다 조직 문화에 대 한 시스템의 설치의 회로도 보여준다. 배관으로 연결 하는 두 개의 채널 슬라이드 이것에 의하여 이루어져 있다. 미디어 셀에 걸쳐 주사기 펌프에 의해 구동 됩니다. 이 슬라이드의 첫 번째 가스 투과성 거품 트랩 (버퍼 슬라이드) 역할을 하며, 두 번째 셀 포함 생물 발광은 기록 하는 셀을 포함 하. 이 시스템에서 비디오를 녹화 하는 대표는 그림 2B에 표시 됩니다. 15 분 노출 매 15 분을 촬영 했다. 표준 관류 조건 또는 카 세 인 키 니 아 제 억제 물 PF670462, 이전 circadian 기간을 길게 하 고 경작에 시계 유전자 식 리듬의 진폭을 감소를 보여왔다 존재 셀의 유지 관리 하는 자, 포유류 세포14. PER2::LUC 식에 미치는 영향의 정량화와 그림 2C (하단 패널)에 표시 된 표준 정적 셀 문화 조건 하에서 약물의 동일한 농도로 처리 하는 셀에 대 한 그림 2C (상단 패널)에 표시 됩니다. 그림 2D에 나와 있습니다. 그것은 이것에서 PF670462 치료 조건의 두 세트에서 PER2::LUC 식 영향입니다. 그러나, 동안 셀 끼얹는다 조건 표시 기간 길어 약 3 h (3 ±0.9 h)에서 PF670462로 치료, 약물으로 치료 하는 정적 조건에서 셀 표시의 기간에 실질적으로 더 큰 기간 길이 &#62; 48 h. 이 섹션 7에 설명 된 대로 감쇠 코사인으로 들어갈 수 있는 (사각형의 여분 합계 F 대 직선 p 테스트 &#60; 0.0001). 흥미롭게도, 관류에서 기간 연장의 진도 훨씬 vivo에서14관찰에 가까운 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
그림 1: 데이터 예제. (A) 예를 들어 6 x 96에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷 잘 생물 발광 인큐베이터에 접시. 웰 스를 측정할 수 있다 보조 비디오 1에서 노란색으로 강조 되었다. A.에서 생물 발광의 부 량 (B) 두 셀의 3 판 서로 반대 PER2 단백질 식의 단계 생산을 반대로 phasic 했다 온도 사이클 (32 ° c h 12; 12 h, 37 ° C에서)를 사용 하 여 개입 했다 (n = 6, ± SEM을 의미). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
그림 2: CK1δ 억제제와 관류. 관류 시스템의 (A) 회로도 (B) 예를 들어 PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 비디오 스냅샷 관류에서 세포. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. PER2::LUC 섬유 아 세포 관류에서 고 3 µ M CK1 억제제 PF670462 없이 정적 조건에서의 생물 발광의 (C) 정량화 (n = 3, ± SEM을 의미). 생물 발광은 최소 및 최대 값을 정규화 되었습니다. (D) 분석 기간 (양방향 ANOVA, Holm Sidak 여러 비교 테스트).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>최종 중간 농도 (μ M)</td>
			<td>주식 (mg/mL)</td>
			<td>400 mL NS21에 대 한</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소 민</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>카 탈 라 제</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>티</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>인슐린</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>홀로 처리가</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-카 르 니 틴</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>방법</td>
			<td>16</td>
			<td>액체 (1 g/ml)</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-갈 락 토스</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 밀리 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 밀리 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나트륨 Selenite</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 놀 레 산</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 놀 렌 산</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 포 산</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>황 체 호르몬</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0.04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>레 티 놀 아세테이트</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, 모든 트랜스</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-알파-토 코 페 롤</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-알파-토 코 페 롤 아세테이트</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: NS21 준비입니다.
보충 비디오 1: 예제 비디오 잘 플레이트에서 생물 발광의. 예를 들어 생물 발광 인큐베이터에서 6 x 96 잘 접시에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷. 웰 스 측정할 수를 노란색으로 강조 표시 됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 2: PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 예제 비디오 스냅샷 세포 관류에서. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

Research

JoVE Journal

Biology

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

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연구

생물학

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