Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Nos gustaría agradecer a Cairn investigación por trabajar con nosotros para desarrollar este sistema, en especial Mark Henson, Jeremy Graham y Joao Correia. También agradecemos a David Welsh y Akhilesh Reddy valiosa discusión durante la fase de diseño, así como Peter Laskey (antes de Hamamatsu) para organizar el préstamo de una cámara de demo y David Wong por su aporte crítico al manuscrito.

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro.">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Buhr, D. E., Yoo, S. -. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators.">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li><li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks.">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li><li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling.">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li><li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts.">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li><li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection.">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres, ., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

No hay conflictos de intereses existentes.

El protocolo descrito aquí es para cultura de células de mamífero, tanto bajo condiciones de perfusión y estática. Sin embargo, el cocodrilo puede ser fácilmente adaptado a otros sistemas modelo. De hecho, ya se ha demostrado para proporcionar una excelente plataforma para la monitorización simultánea de locomoción, el sueño y ritmos de expresión periférica gene en Drosophila melanogaster mantenida en oscuridad constante15. También se observa que, dependiendo de la aplicación, tipo de cámara que no sea mencionado aquí puede ser apropiado. Prevemos que con los filtros adecuados, una versión modificada de la actual configuración podría en principio utilizar para la cuantificación de la fluorescencia.
Las aplicaciones sólo para que el cocodrilo no sería apropiado son los que se requiere, como proyección de imagen de la organización espacio-temporal de la expresión PER2::LUC en rodajas organotypic de los mamíferos particularmente alta resolución espacial núcleo supraquiasmático, u otros sectores pequeños de tejido.
El cocodrilo permite muchos experimentos a realizar que hasta ahora no han sido fácilmente alcanzables por técnicas de grabación convencional. En comparación con los métodos actuales para la medición de la bioluminiscencia, el caimán ofrece mayor flexibilidad en el tipo de placa de cultivo celular o diapositiva que puede ser utilizado, las condiciones de medios externos, sensibilidad y procesividad.
Esto es particularmente relevante en un momento cuando hay un alejamiento de los modelos de cultura estándar celular 2D a 3D organoides y el flujo de los sistemas de cultivo. Como tal, se prevé que el caimán proporcionará un método adaptable que puede medirse bioluminiscencia durante muchos días bajo una amplia gama de condiciones.

El uso de luciferasas como reporteros de expresión génica y actividad de la proteína se ha convertido en una técnica popular en la investigación de la biología molecular y celular. Esto es cierto en el campo circadiano, siendo particularmente idóneo para informar los cambios longitudinales en la expresión génica que ocurren durante el ciclo circadiano h aproximadamente 24 la cinética de inactivación catalítica y de síntesis de luciferasa de luciérnaga. Como tal, luciferasa se emplea como un reportero circadiano a través de una amplia gama de microorganismos, incluyendo hongos, plantas, moscas y mamíferos1,2,3,4.
Cuando la cuantificación de la expresión de genes circadianos en vitro, un tubo fotomultiplicador (PMT) se utiliza comúnmente para grabar la señal bioluminiscente. Medidas basadas en el PMT es limitada flexibilidad sin embargo, generalmente se limita a un determinado tamaño de plato o plato. También no es posible recabar toda la información espacial de las muestras monitoreadas usando un PMT, que puede conducir a una pérdida de información cuando las muestras que indican variación espacial en la expresión de la luciferasa de la proyección de imagen. Además, como el PMT y el asociado son propensos a un mal funcionamiento cuando se expone al ambiente humidificado de una incubadora de cultivo de célula estándar, grabación longitudinal luciferase usando PMT se realiza siempre en incubadoras no humidificado. En consecuencia, platos de cultivo celular deben sellarse herméticamente para evitar la pérdida de humedad por evaporación y los medios de cultivo por lo tanto debe ser protegido con 3-(N- morfolino) el ácido propanesulfonic (MOPS) o 4-(2-hidroxietil) -1- -1-ácido ácido (HEPES), más que el CO2/bicarbonate buffering sistema que funciona en vivo y se utiliza rutinariamente en cultivo de tejidos de mamífero.
Como resultado de estas limitaciones, medición de bioluminiscencia por PMTs generalmente impone restricciones apretadas sobre las condiciones bajo las cuales las células se mantienen durante los experimentos. Para superar estos problemas y también para aumentar el rango de condiciones experimentales, utilizamos una estándar CO2/N2 170 L cultivo de tejidos incubadora que ha sido adaptada por la adición de una agua fría electrón-multiplicar dispositivo de carga acoplada (EMCCD) cámara con ópticas antiniebla y control digital de temperatura y gas. Esto ha sido denominado un automatizado la proyección de imagen de Luciferase Longitudinal Gas y grabadora de Temperature-Optimized o cocodrilo. El cocodrilo permite flexibilidad substancialmente creciente de imágenes bioluminiscentes, tanto para la proyección de imagen de alto rendimiento de las placas de cultivo de tejidos estándar (hasta 6 x 96 o 384-bien placas al mismo tiempo) y también para los sistemas de cultivo de tejidos no estándar, tales como perfusión células cultivadas en dispositivos microfluídicos. Este instrumento también permite la proyección de imagen para ocurrir bajo condiciones humidificadas y con control variable de tanto CO2 y presión parcial de O2 así como temperatura.
El protocolo a continuación describe un método para la grabación bioluminiscente de células de mamífero y sistemas de cultivo de tejidos con un caimán (en adelante referido como 'incubadora' de bioluminiscencia). Sin embargo, cabe señalar que el sistema sería idóneo para la proyección de imagen bioluminiscente y también, con alguna modificación, fluorescente de la proyección de imagen, en un número de otros sistemas biológicos y contextos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

Reporteros de luciferasa basado de la expresión génica celular son de uso generalizado para ambos longitudinal y punto final ensayos de actividad biológica. En la investigación de los ritmos circadianos, por ejemplo, fusiones de genes reloj con luciferasa de luciérnaga dan lugar a ritmos robustos en bioluminiscencia celular que persisten durante muchos días. Limitaciones técnicas asociadas con los tubos de fotomultiplicador (PMT) o métodos convencionales basados en la microscopía para la cuantificación de la bioluminiscencia han exigido normalmente que las células y los tejidos se mantenga en condiciones absolutamente fisiológico durante grabación, con una relación inversa entre la sensibilidad y rendimiento. Aquí, Divulgamos un refinamiento de métodos anteriores que permite imágenes de bioluminiscencia a largo plazo con alta sensibilidad y rendimiento que apoya una amplia gama de condiciones de cultivo, incluyendo gas variable y control de humedad, y que acepta muchas diferentes platos y placas de cultivo de tejidos. Este luciferase longitudinal automatizada optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) la proyección de imagen también permite la observación de las variaciones espaciales en la expresión de luciferasa en una monocapa de células o tejido, que no puede ser observado fácilmente por el tradicional métodos. Destacamos cómo el cocodrilo proporciona flexibilidad mucho mayor para la detección de actividad de luciferasa en comparación con los métodos existentes.

Este artículo describe un protocolo para la proyección de imagen bioluminiscente de las células mamíferas usando un cocodrilo (incubadora de bioluminiscencia). Esta técnica permite flexibilidad de configuración física y condiciones extracelulares cuando proyección de imagen sistemas bioluminiscentes. Se describen métodos para cultivo de células inundado (figura 2, 2 de Video suplementaria) y simple cultura estática del tejido (figura 1, 1 de Video suplementaria), pero muchas otras configuraciones podrían ser reflejadas mediante este sistema. Todos los datos fueron cuantificados mediante los métodos descritos en la sección 7.
Figura 1A se muestra un ejemplo video de una bioluminiscencia grabación de placas 6 x 96 pocillos que contienen fibroblastos PER2::LUC4. Los pozos exteriores no contienen células como éstos no fueron necesarios para este experimento. Las células han sufrido arrastre diferencial de temperatura, por el que se someten a cualquier ciclo de temperatura de 12 h a 32 ° C, seguida por 12 h 37 ° C por 72 h o converse (12 h, a 37 ° C seguida por 12 h, a 32 º C durante 72 h), antes recluidos en constante de 37 ° C para la grabación. exposiciones de 60 min fueron tomadas cada hora. Dos de estas condiciones se cuantifican en la figura 1B.
Figura 2A muestra un esquema de la instalación de un sistema de cultivo de tejidos perfundido. Esto consiste en dos muestras de canal conectados con la tubería. Los medios de comunicación es conducido a través de las células por una bomba de jeringa. La primera de estas diapositivas actúa como una trampa de burbuja permeable al gas (diapositiva de buffer) y no contiene ninguna célula, con el segundo que contiene las células que se registra la bioluminiscencia. Un representante de grabación de video de este sistema se muestra en la figura 2B. exposiciones de 15 minutos fueron tomadas cada 15 minutos. Aquí, las células se mantienen en condiciones de perfusión estándar o en presencia de inhibidor de la quinasa de la caseína PF670462, que se ha demostrado previamente para alargar período circadiano y reducir la amplitud de ritmos de expresión de genes reloj en cultivo las células mamíferas14. El efecto sobre la expresión de PER2::LUC se muestra en la figura 2 (panel superior) contra las células tratadas con la misma concentración de droga bajo condiciones de cultivo de célula estática estándar que se muestra en la figura 2 (panel inferior), con cuantificación de período se muestra en la Figura 2D. Es claro de esto que el tratamiento con PF670462 influye en la expresión de PER2::LUC en ambos grupos de condiciones. Sin embargo, mientras que las células trataron con PF670462 bajo condiciones perfundidas Mostrar alargamiento período de aproximadamente 3 h (3 h ±0.9), las células en condiciones estáticas tratadas con el fármaco mostraron alargamiento período sustancialmente mayor a un periodo de &#62; 48 h. Esto puede caber por un coseno amortiguado, como se describe en la sección 7, (extra suma de cuadrados F prueba frente a una línea recta, p &#60; 0.0001). Curiosamente, la magnitud del alargamiento período bajo perfusión es mucho más cercana al observado en vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figura 1: ejemplo de datos. (A) ejemplo video snapshot de bioluminescence de PER2::LUC inmortalizado en 6 x 96 bien las placas en la incubadora de la bioluminiscencia. Pozos para cuantificar se han destacado en amarillo en el Video complementario 1. (B) cuantificación de bioluminiscencia A. Dos juegos de 3 placas de células fueron atrapados con los ciclos de temperatura (12 h a 32 ° C, 12 h, a 37° C) que eran anti-fásicos entre sí para producir frente a fases de expresión de la proteína PER2 (n = 6, media ± SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figura 2: perfusión con inhibidores de la CK1δ. (A) diagrama esquemático del sistema de perfusión. (B) ejemplo de vídeo instantánea de una bioluminiscencia grabación de PER2::LUC de las células bajo perfusión. Un área de muestra de cuantificación es resaltada en amarillo. (C) cuantificación de bioluminescence de los fibroblastos PER2::LUC en perfusión y en condiciones estáticas con y sin inhibidor de CK1 de 3 μm PF670462 (n = 3, media ± SEM). Bioluminiscencia ha sido normalizada a los valores mínimos y máximos. (D) análisis de período (ANOVA de dos vías, test de comparaciones múltiples de Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentración media final (μM)</td>
			<td>Valores (mg/mL)</td>
			<td>Para 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albúmina bovina</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalasa</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutatión</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superóxido dismutasa</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrina</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triyodotiroacético-L-tironina)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitina</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolamina</td>
			<td>16</td>
			<td>Líquido (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-galactosa</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescina</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenito de sodio</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterona</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linoleico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido linolénico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido lipoico</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterona</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetato de retinol</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, todo el transporte</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tocoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tocoferol acetato</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: NS21 preparación.
1 Video complementario: video ejemplo de bioluminiscencia de las placas bien. Captura video de ejemplo de bioluminiscencia de PER2::LUC inmortalizado en placas bien 6 x 96 en la incubadora de la bioluminiscencia. Pozos para cuantificar se resaltan en amarillo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
2 Video complementario: captura video de ejemplo de una bioluminiscencia grabación de PER2::LUC de las células bajo perfusión. Un área de muestra de cuantificación es resaltada en amarillo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

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